[發明專利]鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1－GapC及其制備方法

無效

• 申請號: 200710041199.2
• 申請日: 2007-05-24
• 公開（公告）號: CN101066464A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發明（設計）人: 陳宇光;陳濤;沈彥萍
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C12N15/31
• 代理公司: 上海上大專利事務所
• 代理人: 何文欣

技術領域

本發明涉及一種鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC及其制備方法。

背景技術：

近年來，隨著基因治療技術的發展DNA疫苗得到了廣泛的關注。DNA疫苗(DNAVaccine)又稱基因疫苗(Genetic?Vaccine)或“裸”DNA疫苗，它是由插入有一種或多種外源抗原基因的質粒DNA和真核啟動調控等基因元件構成。與傳統的疫苗相比，DNA疫苗有很多獨到的優勢：外源抗原的表達與病毒自然感染相似，均為胞內表達，表達的產物能夠進行翻譯后修飾；具有與天然抗原相同的構象和免疫原性，可以同時激發機體產生細胞免疫、體液免疫和粘膜免疫應答，而且不受母源抗體的干擾；結構簡單，制備方便，易于標準化；安全性好，無副作用，也沒有減毒活疫苗毒力返強的危險性；穩定性好，易于保存和運輸；能夠克服新生動物由于免疫系統發育不完全而導致的免疫力低下的缺陷；可將編碼不同抗原的基因構建在同一個質粒中，或將攜帶不同抗原基因的多種重組質粒聯合應用，制備多價疫苗或聯苗。

發明目的：

本發明的目的之一在于提供一種鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC。

本發明的目的之二在于提供該鏈球菌DNA疫苗的制備方法。

為達到上述目的，本發明選取廣泛存在于鏈球菌表面的脫氫酶GapC作為外源抗原基因和真核表達質粒pcDNA3.1作為載體，構建DNA疫苗pcDNA3.1-GapC。GapC具有3-磷酸甘油醛脫氫酶活性，可以與血纖維蛋白溶酶結合，在疾病發展過程和信號傳導過程中起重要作用，被認為是非常好的阻止寄生蟲，真菌和細菌感染的疫苗靶點。真核表達載體pcDNA3.1含有HCMV-IE1啟動子/增強子復合體、多克隆位點、BGHpolyA及氨芐青霉素抗性基因。氨芐青霉素抗性基因，含有2個可顯著增強免疫效果的六寡核苷酸序列5′-AACGTT-3′，此序列含CpG結構，稱為免疫激活DNA序列(ISS)，通過非特異性多克隆激活作用可激活抗原呈遞細胞，可以提高核酸疫苗免疫的效果。

根據上述機理，本發明采用如下技術方案：

一種鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC，其特征在于該疫苗具有SEQ?NO?3所示的堿基序列。

上述的鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的編碼蛋白，其特征在于具有SEQ?NO4所示的氨基酸序列。

上述的鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的制備方法，其特征在于該方法為：根據停乳鏈球菌GapC上下游序列設計引物：

上游引物：5’-GGGGCTAGCACCATGGTAGTTAAAGTTGGTAT-3’

下游引物：5’-GGGGGTACCTCATTATTTAGCGATTTTTGCAA-3’

為了在上游引物中加入真核增強翻譯序列Kozak序列(A/GCCATGG)，在ATG前加入ACC三個堿基.下游引物中加入2個連續的終止密碼子；以停乳鏈球菌基因組DNA為模板，加入上游引物和下游引物進行PCR擴增：94℃變性5min，然后94℃30s，57℃1min，72℃1min，循環30次，72℃復性10min，得到GapC基因；然后用NheI，KpnI雙酶切后，與同樣用NheI，KpnI雙酶切的pcDNA3.1載體連接，構建重組載體pcDNA3.1-GapC。

DNA疫苗作為新型的第三代疫苗，與傳統的滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗具有如下優點：①免疫保護力增強；②制備簡單，省時省力；③同種異株交叉保護；④應用較安全；⑤產生持久免疫應答；⑥貯存、運輸方便；⑦可用于防治腫瘤。具有廣闊的發展前景。

本發明所構建的DNA疫苗免疫小鼠后，能誘導機體產生體液免疫反應和細胞免疫反應。

附圖說明：

圖1為鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的構建流程圖。

圖2為PCR獲取的GapC基因和DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的雙酶切鑒定圖。其中1表示pcDNA3.1-GapC用NheI和KpnI雙酶切，2表示PCR擴增得到的GapC基因，3表示marker(bp)。

圖3為高密度培養pcDNA3.1-GapC/DH5α的生長曲線圖。

圖4為鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的小鼠體液免疫效果圖。

具體實施方案：

實施例一：DNA疫苗pcDNA3.1-GapC構建以及基因工程重組菌pcDNA3.1-GapC/DH5α的制備

根據停乳鏈球菌GapC上下游序列設計引物：