[發明專利]高密度蛭弧菌游泳體的發酵培養技術

無效

• 申請號: 200710031166.X
• 申請日: 2007-10-30
• 公開（公告）號: CN101173231A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 蔡俊鵬;王澤秀
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 盛佩珍

技術領域

本發明屬于發酵工程領域，具體是指一種可應用于減少、甚至完全消除有害菌的高密度蛭弧菌游泳體的發酵培養技術，不僅在水源性、食源性致病菌防治方面，而且在醫學、環境污染、農業、工業、軍事領域等方面將具有巨大的應用和發展前景。

背景技術

雖然采用生物防治的手段消除致病菌是當今世界工、農、醫等各個領域的研究熱點，但是目前消除致病菌的主要手段仍是各種物理和/或化學的方法，包括各種抗生素的使用。這些方法都存在著明顯的弊端，首先，抗生素大量濫用，會導致一些副作用的產生，如病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等。其次，酸堿處理的方法雖可達到一定的滅菌/殺菌效果，但在有害菌形成生物膜后，這些方法的效果就相當的不理想。最后，物理的方法對各種致病菌的消除作用只能應用于相關領域的某一環節，而難以擴展到整個領域的所有環節。然而，生物防治的方法則可具有強大的優越性，極有可能使其服務于日常生活的病害防治以及生物戰和恐怖襲擊中大規模的水源性、食源性污染的處理等。

蛭弧菌能降解保護性細胞外聚合物并裂解宿主細胞的特性使其具有巨大的應用前景。首先，蛭弧菌的宿主范圍廣泛，對動物、日常生活等常見致病菌都有較強的清除作用，且對致病菌的裂解能力明顯大于非致病菌，蛭弧菌制劑在清除致病菌的同時，對環境中的有益菌危害不大，而以有益菌作為宿主菌培養蛭弧菌的則例外；其次，蛭弧菌作為一種抗微生物因子幾乎沒有宿主抗性，能對致病菌發揮穩定持久的裂解作用，它能有效地預防自身基因組與其它細菌基因組之間發生基因重組和基因水平轉移，并且也沒有噬菌體所具有宿主過于專一的缺點；再次，蛭弧菌還可抵御自然界中某些有毒物質，其基因組可以編碼多種有毒物質的抗阻蛋白，這預示蛭弧菌有可能成為新型抗生素或消毒劑。有研究表明，蛭弧菌不能存活于真核細胞內，由此揭示它對人體的危害極小；最后，蛭弧菌在沒有宿主菌存在的環境中會因為“饑餓”而死，因此，使用蛭弧菌制劑不存在殘留問題。

目前，中國200610039346.8號發明專利申請中提出了一種生產噬菌蛭弧菌制劑的方法，該方法所生產的蛭弧菌制劑的應用，雖然可解決目前用抗生素等方法導致的副作用問題，但其所生產的蛭弧菌制劑密度較低，導致使用量較大，成本較高，且是以有益菌作為宿主菌培養蛭弧菌、以蛭質體或/和游泳體混合物的形式作為終產品，存在著雜菌帶入、作用滯后、潛在使用范圍窄、對有益菌裂解能力過強等缺點。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種高密度蛭弧菌游泳體的發酵培養技術，進而生產一種能廣泛適用于水源性、食源性致病菌防治以及醫學、環境污染、農業、工業、軍事領域等的高密度的蛭弧菌游泳體制劑。

為達到上述目的，本發明的主要技術方案如下：高密度蛭弧菌游泳體發酵培養技術，該技術的步驟及其工藝條件如下：

步驟一：宿主菌懸浮液的制備：

將宿主菌接種于常規培養基(即營養肉湯培養基)中，置于20～40℃搖床中培養12～24h，使其處于對數生長期，培養液在2～15℃，5000～8000rpm離心15～40min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入與其體積比為0.05～2％稀營養肉湯DNB培養液，即得到濃度達10¹⁸～10²⁶CFU/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2～15℃冰箱中保存備用；

步驟二：蛭弧菌游泳體濃縮液的制備：

在稀營養肉湯DNB培養液中先加入步驟一制備的宿主菌懸浮液，使宿主菌在DNB液體中的濃度達10¹⁰～10¹⁸CFU/mL，再接入用常規方法培養出來的蛭弧菌斑，然后將此培養液在20～40℃培養20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm離心15～40min，保留上清液棄去沉淀，將上清液再在2～15℃，10000～20000rpm離心15～40min，保留沉淀棄去上清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，往沉淀中加入與其體積比為0.05～2％DNB培養液，混勻即得到濃度達10⁶～10⁸PFU/mL蛭弧菌游泳體濃縮液，然后將此濃縮液置于2～15℃冰箱保存備用；

步驟三：高密度蛭弧菌游泳體的發酵培養工藝：