[發明專利]HLA－A基因分型用微陣列芯片的制備及其用法

有效

• 申請號: 200710029306.X
• 申請日: 2007-07-24
• 公開（公告）號: CN101353694A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 胡守旺;張帆;胥順;李明;程鋼;何蘊韶
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域?

本發明涉及一種臨床檢測用途的基因檢測試劑盒，尤其是涉及采用DNA微陣列芯片技術和雙溫度雜交方法，該試劑盒能夠高通量、高效率、高特異性對HLA-A基因進行分型。?

技術背景?

HLA(Human?leukocyte?antigen，人類白細胞抗原)是人類主要組織相容性系統。組織相容性是指不同個體間進行組織或器官移植時，供者和受者雙方接受的程度。供受者組織不相容引起的反應，被證實是一種免疫反應，它是由細胞表面同種異型抗原誘導的，這個代表個體特異性的抗原稱移植抗原或組織相容性抗原，其中起主要作用的抗原稱主要組織相容性系統(MHS)，HLA(人類白細胞抗原)就是人類的主要組織相容性系統。HLA基因復合體位于人類第6號染色體6p21.3區域，具有高度單核苷酸多態性(SNPs)。HLA存在多個基因座位，其中HLA-A座位是影響移植排斥反應的主要座位之一。SNPs是決定組織相容性的本質因素，個體之間的SNPs差異程度決定著相容性程度。HLA-A基因座位的SNPs主要集中在第二外顯子長度約300bp的片段上。根據SNPs的差異特點，可以進行基因分型，將HLA-A基因座位分成不同的型別和亞型，型別和亞型相同者，SNPs差異較小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技術廣泛應用于造血干細胞移植、器官移植、疾病關聯研究。?

HLA-A基因分型方法是從90年代開始發展起來的，目前主要包括PCR-SSP(PCR-序列特異性引物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特異性寡核苷酸探針法)、SBT(測序法)、FCM(流式法)方法。這些方法目前被西方國家的少數企業壟斷，我國處于空白狀態，完全依賴進口。同時，這些方法也存在一些技術問題，比如引物過多造成檢測錯誤、探針雜交單一溫度造成特異性降低、檢測通量過小等等。?

DNA微陣列法是近幾年發展起來的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、集約化、低成本、高準確性等特點，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值，又具有明顯的產業化前景。由于用該技術可以將極其大量的探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量的生物分子進行檢測分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少、低通量等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序(Sequencing?by?hybridization，SBH)等，為“后基因組計劃”時期基因功能研究及現代醫學科?學、醫學診斷學的發展提供了強有力的工具。?

發明內容

鑒于目前現有HLA-A基因分型方法的不足，本發明將DNA微陣列技術應用于HLA-A基因分型，開發了一種新型的基因分型試劑盒。?

本發明所采用的技術方案是：針對HLA-A基因座位的第二、三外顯子，設計二套特異性寡核苷酸探針(附表1)，采用自動點樣機器人，將二套探針印制在兩張玻片的特定區域，每張玻片印制16個微陣列矩陣，這樣就制成高密度DNA微陣列，二張芯片可以檢測16個樣本，再配以其它必要的組份，包括PCR引物(表2)組成完整的試劑盒。實際檢測時，取16份人基因組DNA溶液，采用CY3標記引物和不對稱PCR方法，擴增出人基因組HLA-A基因的第二、三外顯子單鏈CY3標記片段。取DNA微陣列玻片一對，在第一張玻片的16個雜交區域，分別加入16種PCR產物2ul和雜交液8ul；在第二張玻片的對應區域，加入同樣的成分。將一對玻片放在自動雜交洗滌儀的兩個雜交槽內，分別將第一、二張玻片的雜交溫度設定為52℃和45℃，雜交時間30分鐘，自動洗滌吹干。取出玻片，放入GenePix4100A掃描儀進行掃描，使用分析軟件對掃描圖像信號進行圖像數據轉換處理，并分析產生樣本基因型別結果。?

本試劑盒采用高密度DNA微陣列技術，可以大大提高檢測通量，每二張玻片可以制備用于檢測16個樣本的DNA微陣列，一般是現有檢測技術的10倍以上；同時，由于采用了雙片雙溫度雜交的特殊方法，避免了現有產品因為雜交溫度不適造成的探針雜交結果假陽性和假陰性問題，大大提高了產品的特異性。?

本發明針對HLA-A第2、3外顯子基因序列的多態性，設計53種分型用寡核苷酸探針，探針分為兩組，見表1，第一組35種探針，雜交溫度為52℃；第二組18種探針，雜交溫度45℃。?

表1?HLA-A基因分型寡核苷酸探針?

表2引物序列?