[發明專利]IL－12表達載體及該載體表達的真核細胞株及應用

有效

• 申請號: 200710028952.4
• 申請日: 2007-07-02
• 公開（公告）號: CN101200730A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發明（設計）人: 粟寬源;柴玉波;劉勇;李鼎峰;夏書奇;曾振飛
• 申請（專利權）人: 廣州市愷泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/24;C12N15/85;C12N5/10;A61K38/20
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說本發明涉及白細胞介素12高效真核表達載體的構建，哺乳動物細胞的轉染，rhIL-12高效表達細胞株的篩選、鑒定和rhIL-12的制備以及藥學應用。

背景技術

rhIL-12(recombinant?human?interleukin?12，rhIL-12)是一種分子量為75KD的糖蛋白，是由兩個亞單位P35、P40靠二硫鍵連結形成的異源二聚體。IL-12具有抗病毒、抗腫瘤以及腫瘤轉移的能力，主要是它可以激活細胞毒性T淋巴細胞((Brunda?etal.(1993)J.Exp.Med.178，1223-1230；)，并與其刺激產生IFN-γ有關(Nastala，C.Journal?of?Immunology，1994；153：1697-1706；Seder，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993；90：10188-10192)。目前已知IL-12是一種較好的細胞免疫的啟動因子，可以作為增強細胞免疫的佐劑，具有巨大的應用前景。

國內外已經利用腺病毒、逆轉錄病毒、EB病毒、腺伴病毒以及桿狀病毒等載體表達IL-12。由于IL-12是一種糖蛋白，哺乳動物細胞表達系統是最理想的選擇。在真核細胞表達體系中，陳慰峰(生物化學與生物物理進展.1998；25：254-258)、劉錳等采用共轉染的方式在CHO細胞中表達，羊東曄(湖南醫科大學學報2003；28：338-342)利用雙啟動子控制表達IL-12的雙亞基，而陳詩書(中國生物化學與分子生物學報，1999；15：48-53)則采用IRES連接小鼠IL-12雙亞基，在COS細胞中表達。以上各種表達，由于轉染效率、整合效率等的不均一性，導致表達效率不一、雙亞基表達水平差異、雙亞基相互不匹配等。目前已知正常細胞中IL-12的表達水平主要是由p35決定的，而一般情況下p35表達水平偏低，導致IL-12的表達水平難以大幅度提高，其生產和應用受到很大的限制。本發明解決了IL-12的這個關鍵問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達rhIL-12的載體，利用該載體在哺乳動物細胞系中高效表達rhIL-12及方法和其藥學應用，所述的rhIL-12是通過基因工程技術制備的。

在第一方面，本發明提供了一種獲得高效表達rhIL-12表達載體的方法。已經有資料表明，白介素12的兩個亞基p35和p40，在哺乳動物細胞中表達水平是不匹配的，通常是p40亞基表達水平較高，而p35亞基表達水平較低，導致rhIL-12的表達水平較低。針對現有rhIL-12中兩個亞基表達不匹配、轉染細胞后通常難以篩選得到高表達目的克隆的問題，對表達rhIL-12的載體進行全新的設計：本發明將p35亞基轉錄本和p40亞基轉錄本構建在一個載體中。每一個亞基都分別由CMV啟動子控制，從而保證兩個亞基p35和p40都獲得有效表達。本發明用以下兩種方法提高p35亞基的表達水平，即在p35亞基的啟動子之前設計了SV40的增強子元件，在啟動子與p35亞基序列之間又引入了Intron元件(Buchman，AR.Mol.Cell.Biol.1988；8，4395-4405.)，形成一個p35亞基的表達單元，更進一步，將兩個p35亞基表達單元串聯在同一個載體中，以增加p35的表達水平。在p40亞基與篩選標記(Neo)基因之間引入IRES序列，以提高抗性篩選基因的表達水平，從而在保證較高壓力條件下，更容易篩選得到所需克隆。通過以上設計，所獲得的人IL-12表達載體主要結構如下：SV40Enhancer-pCMV-Intron-p35-SV40Enhancer-pCMV-Intron-p35-pCMV-p40-IRES-neo。利用上述載體轉染的細胞株，易于獲得高表達的、匹配較好的rhIL-12的兩個亞基，進而獲得高活性的rhIL-12。

本文中所用的術語“蛋白質”、“蛋白”、“多肽”具有相同的含義。本文中“rhIL-12”與“人IL-12”可以相互替換使用。當用基因工程手段表達本發明的蛋白時，根據生產中所使用的宿主細胞的不同，如，酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、哺乳動物乳腺反應器等，本發明的蛋白的糖基化形式可以是不一致或不均一的。

本發明中的人IL-12，除天然存在的氨基酸的形式外，亦包括其N末端帶有甲硫氨酸的形式、兩個亞基的各類突變體形式以及其截短突變體等。

優選地，本發明的人IL-12兩個亞基的氨基酸序列如附錄1a和附錄1b所示。