[發(fā)明專利]肝臟疾病血清特異蛋白及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710028695.4
• 申請日: 2007-06-20
• 公開（公告）號: CN101328214A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭濤;古艷麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的肝臟疾病血清標(biāo)志物-高爾基蛋白gp73，屬于生物監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明還公開了血清高爾基蛋白gp73在診斷肝臟疾病上的用途，提供了血清gp73的檢測試劑盒。

背景技術(shù)

肝臟是人體最大的器官，肝臟疾病也是發(fā)病率和死亡率最高的疾病。由于肝臟具有很強(qiáng)的代償能力，部分損傷往往無臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致肝臟疾病潛伏性強(qiáng)，待有臨床表現(xiàn)時，已經(jīng)是肝病晚期，難以有效治療。目前，能夠在臨床上開展的肝功能試驗種類繁多，但是每一種試驗只能探查肝臟的某一方面的某一種功能，到現(xiàn)在為止仍然沒有能反映肝臟的大部分功能的指標(biāo)，因而，往往引起漏檢。

肝臟疾病可分為病毒性的和非病毒性的。肝炎病毒(Hepatitis?Virus)是引起肝臟疾病的主要病原體。目前發(fā)現(xiàn)的肝炎病毒包括甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和戊肝等。非病毒性肝病是由于藥物、毒品、酒精等引起的肝損傷。肝臟疾病的發(fā)展過程一般包括急性肝炎、慢性肝炎、肝臟纖維化、肝硬化(肝腹水)、肝癌等階段。

盡管不同的誘因可引起不同類型和程度的肝損傷，各類早期肝損傷后都會引起肝部的炎癥反應(yīng)(急性肝炎)。炎癥反應(yīng)是人體試圖修復(fù)肝損傷的反應(yīng)，如果在此階段能夠及時診斷和治療，將可以防止肝病向肝癌發(fā)展。

目前肝癌治療最有效的手段是手術(shù)切除，但由于缺乏早期診斷手段，其治療的效果并不理想，65％的肝癌患者發(fā)現(xiàn)并確診時，病情已經(jīng)晚期，失去了根治手術(shù)的時機(jī)，約80％的患者在診斷后很快就死亡，因此肝癌的生存率非常低，這主要是因為目前尚缺乏有效的早期診斷手段。

目前對于肝損傷的診斷主要依靠肝功能檢測。臨床應(yīng)用較為廣泛的肝功能指標(biāo)有：①反映肝細(xì)胞蛋白合成代謝功能的指標(biāo)：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)。②反映肝細(xì)胞有無受損及嚴(yán)重程度的指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AIJT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、腺苷脫氨酶(ADA)、膽堿酯酶(ChE)、乳酸脫氫酶(LDH)等。③反映肝臟膽排泄、分泌及解毒功能的指標(biāo)：總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽酸(TBA)、血氨(NH)。④對診斷膽汁淤積指示酶(包括同工酶)有幫助的酶：堿性磷酸酶(ALP)、r.谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、5-核苷酸酶(5-NT)。⑤反映肝臟間質(zhì)成分增生(肝纖維化和肝硬化)的指標(biāo)：III型前膠原氨基端肽(PIIIP)、III型原膠原(PCIII)、IV型膠原c端原肽(CIV/PC)；層黏蛋白(LN)；透明質(zhì)酸(HA)。⑥對肝腫瘤診斷有意義的血清標(biāo)志物：甲胎蛋白(AFP)。

然而現(xiàn)行的種種肝功能試驗，只能反映肝功能的一個側(cè)面，并不能反映肝功能改變的全貌，到目前為止，仍缺乏令人滿意的有效診斷肝臟疾病的早期檢測手段。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種新的有效檢測肝臟異常的方法。

gp73是主要定位在高爾基體上一種蛋白質(zhì)，是一個II型跨膜蛋白，具有5個糖基化位點，分子量約45KD，糖基化后約為73KD，該蛋白基因序列保守，從兩棲類到靈長類，都有其同源蛋白，功能相當(dāng)保守，在正常人肝臟組織表達(dá)量很低，而有肝臟疾患的病人肝臟中卻大量表達(dá)。國外的相關(guān)研究認(rèn)為，gp73在肝癌患者體內(nèi)表達(dá)量會很高，而病毒性肝炎，肝硬化、肝損傷患者與健康人的gp73含量比較低。他們利用免疫印跡的檢測方法，該方法操作繁瑣，靈敏度和特異性都沒有酶聯(lián)免疫法高。而在我們的研究中顯示，病毒性肝炎，肝硬化和肝損傷患者的gp73含量也明顯高于正常人，因此提出將gp73作為肝臟異常的標(biāo)志物。并且我們還建立了一種快速、靈敏的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明有兩個目的，一是提供一種新的肝臟疾病血清標(biāo)志物，二是提供一種有效的肝臟疾病診斷試劑盒。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種肝臟疾病血清標(biāo)志物，它具有以下特征：

(a)該蛋白主要定位在高爾基體上。

(b)是一個II型跨膜蛋白，具有5個糖基化位點，分子量約45KD，糖基化后約為73KD。

(c)該蛋白基因序列保守，從兩棲類到靈長類，都有其同源蛋白，功能相當(dāng)保守。

(d)在正常人肝臟組織表達(dá)量很低，而有肝臟疾患的病人肝臟中卻大量表達(dá)。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測血清樣品中是否存在本發(fā)明肝臟疾病標(biāo)志物gp73的方法，包括以下步驟：

(a)構(gòu)建gp73重組質(zhì)粒，原核表達(dá)并純化。

(b)用該蛋白免疫小鼠和兔子，制備gp73的特異性單克隆抗體或多克隆抗體。

(c)建立免疫學(xué)檢測方法。

(d)收集健康人和有肝臟疾病患者的血清樣品，檢測血清中g(shù)p73的含量。