[發(fā)明專利]亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒及亞鐵離子濃度測(cè)定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710023234.8
• 申請(qǐng)日: 2007-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN101324608A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王爾中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/84
• 分類號(hào): G01N33/84;G01N21/31;C12Q1/26;C12Q1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定亞鐵離子濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

鐵和總鐵結(jié)合力在人體代謝過程中極為重要。鐵是人體正常生理過程中不可缺少的物質(zhì)。人體含鐵約3～5g，其中70％存在于紅細(xì)胞血紅蛋白中；25％分布在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(即網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，肝、脾、骨髓中鐵蛋白和含鐵血黃素)；4.9％分布于肌紅蛋白、細(xì)胞色素、含鐵的酶；0.1％為循環(huán)血漿中的鐵。

人體內(nèi)的鐵來源于食物，主要在十二指腸和小腸上部被吸收。體內(nèi)鐵以鐵蛋白和含鐵血黃素形成貯存在骨髓、脾和肝臟內(nèi)。有少量鐵與血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，通過血漿輸送至各組織，被利用或被貯存。

血清鐵的測(cè)定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于靈敏度不高及基底的干擾，比分光光度法可靠性差。分光光度法應(yīng)用一類含-N＝C-C＝N-結(jié)構(gòu)的生色原，與亞鐵形成五元環(huán)，產(chǎn)生紫紅色。較早使用的有聯(lián)吡啶和紅移菲羅啉；近來多推薦靈敏度較高的亞鐵嗪。此外，尚有應(yīng)用鉻天青S與高鐵的反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric?Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定亞鐵離子濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行亞鐵離子濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明亞鐵離子濃度測(cè)定方法原理如下：

順烏頭酸+水??烏頭酸酶??檸檬酸

檸檬酸+輔酶A??檸檬酸合成酶??乙酰輔酶A+草酰乙酸+水

乙酰輔酶A+二氧化碳+還原型輔酶??丙酮酸脫氫酶??丙酮酸+輔酶A

?????????????????????????????????????????????+輔酶

這種方法應(yīng)用需要亞鐵離子激活的烏頭酸酶(aconitase；EC?4.2.1.3)酶(偶)聯(lián)檸檬酸合成酶(citrate?synthase；EC?2.3.3.1?&?EC?2.3.3.3)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate?dehydrogenase；EC?1.2.1.51)酶促反應(yīng)速率比色法。烏頭酸酶在亞鐵離子激活下酶解順烏頭酸產(chǎn)生檸檬酸，再通過(偶)聯(lián)合檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的程度/速度，可以測(cè)算亞鐵離子的濃度大小。

實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒較為理想：

緩沖液????????100mmol/L

穩(wěn)定劑????????500mmol/L

還原型輔酶??????0.25mmol/L

順烏頭酸????????10mmol/L

輔酶A???????????5mmol/L

二氧化碳????????30mmol/L

烏頭酸酶????????6000U/L

檸檬酸合成酶????12000U/L

丙酮酸脫氫酶????18000U/L

本發(fā)明的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括：

緩沖液、穩(wěn)定劑、順烏頭酸、輔酶A、二氧化碳、還原型輔酶、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶。

試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩(wěn)定劑、順烏頭酸、輔酶A、二氧化碳、還原型輔酶。

試劑2

緩沖液、穩(wěn)定劑、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶。

順烏頭酸、輔酶A、二氧化碳、還原型輔酶、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。