[發明專利]一株高產核酸酶P1的桔青霉菌及其選育方法

有效

• 申請號: 200710022932.6
• 申請日: 2007-05-25
• 公開（公告）號: CN101067116A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發明（設計）人: 應漢杰;楊蘊毅;賀沁婷;張磊;阮文輝
• 申請（專利權）人: 南京工業大學;南京同凱兆業生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/55;C12N9/22
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 徐冬濤;劉成群

技術領域

本發明屬于微生物誘變技術領域，涉及一種高產核酸酶P1的桔青霉菌及利用離子束注入誘變手段選育該桔青霉菌的方法。

背景技術

從桔青霉發酵液中獲得的核酸酶P1是一種能夠水解RNA獲得四種5’—核苷酸的磷酸二酯酶。5’-核苷酸已廣泛應用于食品、生化工業以及制藥工業。在食品行業中，已經由最初的食品助鮮劑，擴展為具有提高生物體免疫功能的功能性食品添加劑，可以添加在面包、餅干等食品中，尤其在嬰幼兒食品中的使用效果非常明顯，能夠有效增強嬰幼兒抵抗細菌性痢疾的能力，減少腹瀉的發生；在醫藥領域，5’-核苷酸不但能夠作為藥物使用，而且還是許多抗病毒抗腫瘤藥物的生產原料；此外，核苷酸制劑還可以作為動植物生長調節劑，有著明顯的增產、增重功效。

核苷酸生產主要采取三種方法：化學合成法、微生物發酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四種核苷酸的混合物，且酶反應收率較高，國內外工業化生產核苷酸均采用此法。在酶解法制備核苷酸中由桔青霉經液體深層發酵生產核酸酶P1，其酶解產物雜質少后續分離工藝簡單，國外一般采用該方法進行核苷酸的生產。

桔青霉(Penicillium?citrinum)屬于不對稱青霉組，絨狀青霉亞組，桔青霉系。國內桔青霉菌株一般采用紫外誘變和亞硝基胍等方法進行誘變選育。陳信波(湖南農業大學學報，1995，21(4)：382—385)等采用紫外誘變法，酶活為500u/ml。洪亦武等(江西科學，1995，13(4)，224—228)采用亞硝基胍和紫外復合誘變，菌株致死率大于90％，最終酶活為345u/ml。李科德等(微生物雜志，2001，21(3)：28—30)采用紫外誘變與亞硝基胍多次誘變，優化后酶活為1329u/ml。

離子束注入技術作為一種生物品種改良的新技術已在誘變育種、植物轉基因、生命起源和進化以及環境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。在微生物誘變育種的研究中，離子束注入已廣泛用于對微生物菌種誘變育種，并取得了良好效果。離子束注入與傳統誘變源相比，除了具有能量沉積效應外，還有動量傳遞、質量沉積及電荷的中和與交換效應，是一種將物理誘變和化學誘變特性集于一身的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細胞損傷較輕的情況下，誘發強烈地影響生物細胞的生理、生化性能，造成遺傳物質的基本單位-堿基的改變，誘發染色體結構變異(余增亮物理1997，26(6)：333-338)。趙洪英(天津理工學院學報，2001，17(1)：14—17)等用N⁺離子注入慶大霉素產生菌成熟孢子，經篩選得到的菌株產抗生素能力提高27.39％。王紀(微生物學雜志，1998，18(4)：25-28)等通過離子注入誘變篩選得到一株遺傳性能穩定的高產菌，得率較出發菌株提高55％～60％。將離子注入誘變技術應用于桔青霉生產核酸酶P1方面未見相關專利和文獻報道。

發明內容

本發明目的是提供一株高產核酸酶P1的桔青霉菌。

本發明的另一個目的是提供一種利用低能離子束注入誘變手段選育該桔青霉菌的方法。

本發明的目的是通過如下技術方案實現的：

一種高產核酸酶P1的菌株，其分類命名為桔青霉(Penicillium?citrinum)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC?No.2014。

所述菌株的選育方法，該方法是對桔青霉孢子進行低能離子束注入，然后將誘變后的孢子轉接于平板培養基中培養，挑選單個菌株轉接于麥芽汁斜面培養，后經液體發酵培養，篩選出產核酸酶P1酶活高的菌株。

所述菌株的選育方法，其中需采用低能離子束注入誘變的桔青霉孢子是取麥芽汁斜面培養的桔青霉孢子用無菌水稀釋制成10³～10⁸孢子懸浮液，將0.005～1ml濃度的孢子懸浮液分裝于玻璃表面皿中，無菌干燥0.5～2h。

所述菌株的選育方法，其中低能離子為N⁺、Ar⁺、O⁶⁺或C⁶⁺。

所述菌株的選育方法，其中離子注入機靶室內真空度為2×10^-2～2×10^-8，注入能量為0.1kev～1000kev，劑量為5～500×10¹³ions·cm^-2.s^-1。