[發明專利]用酶工程技術生物合成谷胱甘肽的方法

無效

• 申請號: 200710020902.1
• 申請日: 2007-04-03
• 公開（公告）號: CN101054560A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 吳梧桐;勞興珍;鄭珩;李薇
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12P21/02;C12N11/04;C07K1/18
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司
• 代理人: 孫立冰

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種微生物突變株，它具有高產谷胱甘肽能力，本發明還公開了用這個菌株生物合成谷胱甘肽的方法。

背景技術

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一種重要的含有硫氫基的活性三肽，廣泛存在于動植物和微生物細胞中。谷胱甘肽無論在臨床和醫藥還是在食品領域都有廣泛的應用。

谷胱甘肽是人體代謝酶如甘油醛磷酸脫氫酶、乙二醛酸等的輔酶，參與體內三羧酸循環及糖代謝，并具有激活各種酶的作用。谷胱甘肽是體內的自由基清除劑，可抑制脂質過氧化，保護細胞膜，恢復細胞功能。谷胱甘肽對于丙烯腈、氟化物、CO、重金屬、有機溶劑等外源性有毒物質具有解除功效。谷胱甘肽可加強轉甲基、轉甲氨基反應，維持肝細胞正常功能，其還可以抑制白內障以及角膜與視網膜疾病的發展，阻止黑色體形成，并且可減輕由于放射線照射、放射性藥物或腫瘤藥物引起的白血球癥狀減少或由于放射性引起的骨髓組織炎與口腔黏膜炎癥狀。此外，其對藥物性腎損傷、糖尿病、神經病變、腫瘤等也頗為有效。

谷胱甘肽在食品加工工業中也有著廣泛的應用。發達國家如美國將谷胱甘肽作為生物活性添加劑，可起到抗氧化、增強食品風味、保鮮、強化氨基酸等多方面作用，并大量用于保健食品中，正好切合幫助人體排毒和瀉毒的功能性食品的發展主流。

因此谷胱甘肽具有很大的潛在應用市場。多年以來，谷胱甘肽的需求主要依賴進口，供需矛盾突出。

現有的生產谷胱甘肽的方法有萃取法、化學合成法、微生物發酵法等。

萃取法主要是通過溶劑萃取的方法從富含谷胱甘肽的動植物組織等原料中進行分離提取，該方法生產工藝落后、規模小、產量低。

化學合成法制備谷胱甘肽則成本高、反應步驟多、時間長、需光學拆分且存在三廢污染等問題。

微生物發酵法制備谷胱甘肽，則后處理麻煩、成本高、體積大、工業化有一定的困難。因此需要發明一種操作簡便、收率高、成本低、易于工業化大規模生產谷胱甘肽的制備方法。

發明內容

本發明公開了一種含有谷胱甘肽合成酶的菌株，具有高產谷胱甘肽能力，其含有高活力的谷胱甘肽合成酶I(GSH?I)和谷胱甘肽合成酶II(GSH?II)，是發明人采用誘變育種的方法篩選到的一株具有高谷胱甘肽合成能力的釀酒酵母(Saccharomyces?cerebisiae)。此菌株已于2007年1月12日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號是：CGMCCNo.1917。

本發明還公開了誘變育種的方法，該方法包括：取釀酒酵母制備菌懸液；誘變處理；篩選出形成最強紫色的菌落，搖瓶培養，檢驗其谷胱甘肽合成酶活力，篩選出具有高產谷胱甘肽能力的菌株。

上述制備方法中，菌懸液的制備法包括：取待篩選的市售釀酒酵母或酒廠發酵用的釀酒酵母轉入搖瓶培養，28℃振蕩培養24～36h，再取1ml培養液轉接于新鮮培養基中，28℃振蕩培養，使細胞處于對數生長期后離心回收菌體，加入5ml?0.1～0.5mol/L?pH6.0磷酸緩沖液，制成菌懸液。

上述制備方法中，誘變處理法包括：開啟紫外燈預熱10min；制備好的菌懸液4ml移入無菌培養皿中，放入無菌磁力攪拌棒、置磁力攪拌器上，30W紫外燈下方20～30cm處；打開皿蓋，在攪拌狀態下進行紫外照射，劑量為2min或3min。照射完畢后立即離心，回收細胞，并避光保存。

上述制備方法中，具有高產谷胱甘肽能力的菌株的檢出法包括：將誘變處理過的細胞接入搖瓶培養，至對數生長期，離心收集細胞。0.1～0.5mol/L?pH6.0磷酸緩沖液加以懸浮，取0.1～0.2ml稀釋菌液，涂布于含有硝普鹽的固體平板上，28℃培養24～36h，篩選出形成最強紫色的菌落，進行搖瓶培養，檢驗其谷胱甘肽合成酶活力，從而篩選出具有高產谷胱甘肽能力的菌株，經酶反應試驗，該菌株穩定性較好，可反復使用多次，每克濕菌體可收獲約200mg谷胱甘肽。

本發明的菌株可以用于制備谷胱甘肽。

本發明還公開了用本發明的菌株生物合成谷胱甘肽的方法，該方法包括：將菌株用海藻酸鈉包埋法制備固定化細胞；固定化細胞在含有0.1～1％膽酸鈉的底物溶液中進行活化、轉化、分離，即得。

上述制備方法中，海藻酸鈉包埋法包括：篩選菌株經培養2～3天收集的濕菌體細胞懸浮于生理鹽水中，另取海藻酸鈉溶于生理鹽水中，加熱融解，將兩者按1∶1～2∶1的比例混合攪拌均勻，以5～12號針頭將混合物擠入0.1～lmol/L氯化鈣溶液中，同時緩慢攪拌使成形，4℃靜置4～24小時，用生理鹽水洗滌。