[發(fā)明專利]一種腫瘤血管新生體外共培養(yǎng)模型

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710019214.3
• 申請(qǐng)日: 2007-01-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101157908A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁義濤;方勝;余德才;孫喜太
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/06
• 分類號(hào): C12N5/06;C12N5/08;C12N11/04
• 代理公司: 南京中新達(dá)專利代理有限公司
• 代理人: 孫鷗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種腫瘤血管新生，特別涉及一種微囊化腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

背景技術(shù)

在腫瘤生長(zhǎng)早期，實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)到1到2mm后，其繼續(xù)生長(zhǎng)就會(huì)依賴新生血管的形成。在此之前，腫瘤細(xì)胞本身已經(jīng)釋放了大量的促血管新生因子誘導(dǎo)腫瘤血管新生。這些新生血管是腫瘤和外界進(jìn)行物質(zhì)交換的基礎(chǔ)，血管新生與惡性腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，研究血管新生的機(jī)理研究，特別是早期的腫瘤血管新生，顯得非常必要和迫切。

建立腫瘤血管新生模型是研究其形成機(jī)制的重要手段。其中，體外共培養(yǎng)模型是模擬體內(nèi)腫瘤血管新生的有效方法。

共培養(yǎng)是一種模擬體內(nèi)微環(huán)境的最簡(jiǎn)單的模型，主要分為兩種：直接接觸共培養(yǎng)和非直接接觸共培養(yǎng)。

直接接觸培養(yǎng)主要是利用兩種細(xì)胞或組織接觸，通過(guò)旁分泌、自分泌分泌細(xì)胞因子或直接接觸等相互作用方式，但兩種細(xì)胞分離較困難，不便于觀察和后續(xù)檢測(cè)。

在本發(fā)明之前，非直接接觸共培養(yǎng)是共培養(yǎng)體系中一者對(duì)另者的影響是通過(guò)旁分泌的細(xì)胞因子相互作用，但兩者不接觸。由于兩種細(xì)胞容易分離，便于觀察和不影響后續(xù)的檢測(cè)。目前非直接接觸共培養(yǎng)主要采用Martrigel膠、Transwell等。

Matrigel膠是一種從腫瘤中提取出來(lái)的促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物。在室溫下，它形成類似于體內(nèi)的細(xì)胞外基底膜的膠狀結(jié)構(gòu)，把內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在Matrigel膠內(nèi)，內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出新生血管的特征。Matrigel膠方法的局限性是并不能很好模仿體內(nèi)腫瘤和血管內(nèi)皮的微環(huán)境，細(xì)胞分離及提取困難，而且細(xì)胞因子的彌散受到一定的影響。

Transwell是利用細(xì)胞分別培養(yǎng)在兩個(gè)不同的兩個(gè)室中，中間隔有孔底膜，細(xì)胞不能通過(guò)。上下兩室的培養(yǎng)液時(shí)是相通的，從而兩種細(xì)胞就通過(guò)各自分泌的可溶性細(xì)胞因子相互作用。在Transwell室內(nèi)外的細(xì)胞易分離，但Transwell價(jià)格昂貴，尚未能很好模擬體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，孔底膜不能有目的的隔離分子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，設(shè)計(jì)、研制一種微囊化腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種腫瘤血管新生體外共培養(yǎng)模型，其步驟如下：

(1)取腫瘤細(xì)胞充分混勻于2％海藻酸鈉溶液中；

(2)通過(guò)微囊發(fā)生器，將細(xì)胞混懸液噴入100mmol/L氯化鈣溶液內(nèi)使其膠化；

(3)待微膠珠硬化，生理鹽水洗滌；

(4)與0.1％多聚賴氨酸溶液反應(yīng)后，生理鹽水洗滌；

(5)再與0.15％海藻酸鈉溶液反應(yīng)后，生理鹽水洗滌；

(6)用55mmol/L的檸檬酸鈉溶液液化微囊核心后，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(7)微囊化腫瘤細(xì)胞直接用于共培養(yǎng)，或凍存；

(8)取內(nèi)皮細(xì)胞貼壁培養(yǎng)或三維生長(zhǎng)，加入微囊化腫瘤細(xì)胞于同一培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)。

(9)分離腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞，分別行基因和蛋白檢測(cè)以及培養(yǎng)液細(xì)胞因子的檢測(cè)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于微囊化腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)很好模型了體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，特別是腫瘤早期的生長(zhǎng)方式；通過(guò)共培養(yǎng)的方法，很好的模擬了腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用的微環(huán)境；腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞極易分離；微囊化腫瘤細(xì)胞可以凍存于液氮中，一次制作，長(zhǎng)期使用，大大降低了科研人力、財(cái)力需求；另外還可根據(jù)不同研究需要，改變微囊的直徑、截流量和微囊內(nèi)細(xì)胞密度。

具體分析如下：

細(xì)胞微囊化培養(yǎng)是固定化技術(shù)中的一種，它是用一層半透膜將細(xì)胞包裹在珠狀的微囊里，從而使生物大分子和細(xì)胞不能從微囊里溢出，而小分子的物質(zhì)、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜，達(dá)到培養(yǎng)的目的。實(shí)際上，微囊里也是一種微小的培養(yǎng)環(huán)境，因而能使細(xì)胞生長(zhǎng)良好。腫瘤細(xì)胞微囊化后呈三維立體生長(zhǎng)，更接近于體內(nèi)腫瘤早期生長(zhǎng)特點(diǎn)，且微囊內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，可通過(guò)分泌血管新生相關(guān)因子作用于內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，兩者共培養(yǎng)為腫瘤血管新生研究提供了一種新的研究手段。而且，微囊的分子截流量與所使用的多聚賴氨酸的分子量成正相關(guān)，因此通過(guò)調(diào)整多聚賴氨酸分子量大小，可控制微囊的通透性，為細(xì)胞間的分子作用特別是中小分子提供更為簡(jiǎn)便的研究手段。