[發明專利]一種固定化金屬的親和色譜固定相及其制備方法

有效

• 申請號: 200710011036.X
• 申請日: 2007-04-20
• 公開（公告）號: CN101288844A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: 鄒漢法;封順;葉明亮;周厚江
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: B01J20/285
• 分類號: B01J20/285
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及分離與純化技術，具體是一種固定化金屬的親和色譜固定相及其制備方法。?

背景技術

翻譯后蛋白質的修飾是蛋白質組中研究的熱點課題。蛋白質磷酸化作為一種最常見，最重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式，參與了幾乎所有調節生命活動的整個過程，包括細胞的增殖，發育和分化，神經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等，蛋白質磷酸化還是目前所知道的信號的主要傳遞方式。?

蛋白質磷酸化分析的傳統方法如放射性同位素標記、化學修飾、Edman降解以及薄層層析等方法。這些方法操作相對繁瑣，對實驗技能要求較高，蛋白樣品需求量較大，或存在放射性污染等問題，限制了其廣泛使用。?

近些年來用固定化金屬親和色譜來富集磷酸化肽段的方法由于其操作簡單，成本較低，對實驗室要求也不那么嚴格，近些年得到了最為廣泛的應用。該方法的主要原理是利用磷酸化肽段所帶的磷酸根與固定化金屬親和色譜中所固載的金屬離子之間發生作用，而非磷酸化肽不與之發生作用，從而起到分離富集的效果。目前常用于磷酸化肽段富集的固定相多種多樣，主要有瓊酯糖基、淀粉基、Al₂O₃、磁珠以及硅膠基質等，通過用亞胺二乙酸等衍生，利用羧基再與金屬離子如鐵、鎵等螯合，再用于磷酸化肽段富集Aprilita，N.H.等，“Poly(glycidyl?methacrylate/divinylbenzene)-IDA-Fe-III?inphosphoproteomics”，《Journal?of?Proteome?Research》，P2312-2319(2005年)；近些年來TiO₂和ZrO₂微球(Kweon，H.K等，“Selective?zirconium?dioxide-basedenrichment?of?phosphorylated?peptides?for?mass?spectrometric?analysis”，《AnalyticalChemistry》，1743-1749(2006年))也應用于磷酸化肽段的富集，其本身即充當基質，又提供與磷酸化肽段作用的金屬離子。亦有文獻報道利用磷酸酯中的磷酸集團，與鋯等金屬離子相互作用，得到寡核苷酸單分子層，或利用這種現象合成了以硅基質為基礎的固定化金屬親和色譜基質，但以聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物磷酸酯為基質的固定化金屬親和色譜固定相用于磷酸化肽段富集未見報道。?

發明內容

本發明提供一種通過化學反應將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物，鍵合上磷酸酯基團，再與鋯、鐵等金屬離子螯合，實現對磷酸化肽段的高選擇性分離、富集與純化固定化金屬的親和色譜固定相及其制備方法。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

固定相結構式為：?

其中GMA?Polymer為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球，粒徑為100nm-50um；所述固定化金屬為鋯或鐵。?

所述聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物是指甲基丙烯酸縮水甘油酯與乙烯基甲基丙烯酸縮水甘油酯的交聯均聚物，或甲基丙烯酸縮水甘油酯與苯乙烯的交聯共聚物。?

固定相的制備方法包括以下步驟：?

1)氨基化反應：將100-400g/L的氨基化試劑溶液與甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球以5-25ml/1g比例混合，在0-80℃下反應3-12小時，反應后產物用水沖洗至中性，得氨基化微球；?

或將上述甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球采用甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物整體柱替換，泵入流速為0.001-0.5mL/min，即得氨基化整體柱；?

2)將步驟1)中得到每1g的氨基化的微球置于5-10mL無水乙腈溶液中，室溫條件下反應過夜，待用；無水乙腈溶液中含有40-100mmol/L三氯氧磷，40-60mmol/L?2，4，6-三甲基吡啶；?

或將含有40-100mmol/L三氯氧磷，40-60mmol/L?2，4，6-三甲基吡啶的無水乙腈溶液以0.001-0.5mL/min的流速泵入步驟1)得到的氨基化整體柱內，反應過夜；?

3)將50-100倍微球或整體柱體積的水加入步驟2)得產物中，使其充分水解；?

4)將水解后的微球用醋酸或三氟乙酸調至pH?2-3，而后加入100mmol/L的EDTA溶液，比例為1g/5-10mL，震蕩1-2小時，離心，棄去上清液，沉淀用水洗滌3-5次，真空干燥；?