[發明專利]一種固定化金屬的親和色譜固定相及其制備方法

有效

• 申請號: 200710011036.X
• 申請日: 2007-04-20
• 公開（公告）號: CN101288844A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: 鄒漢法;封順;葉明亮;周厚江
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: B01J20/285
• 分類號: B01J20/285
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

1.一種固定化金屬的親和色譜固定相，其特征在于：固定相基質結構式為：

其中GMA?Polymer為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球，粒徑為100nm-50um；

所述固定化金屬為鋯或鐵；

所述聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物是指甲基丙烯酸縮水甘油酯與乙烯基甲基丙烯酸縮水甘油酯的交聯均聚物，或甲基丙烯酸縮水甘油酯與苯乙烯的交聯共聚物。

2.按照權利要求1所述固定化金屬的親和色譜固定相的制備方法，其特征在于：包括以下步驟，

1)氨基化反應：將100-400g/L的氨基化試劑溶液與甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球以5-25ml/1g比例混合，在0-80℃下反應3-12小時，反應后產物用水沖洗至中性，得氨基化微球；

或將上述甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球采用甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物整體柱替換，泵入流速為0.001-0.5mL/min，即得氨基化整體柱；

2)將步驟1)中得到每1g的氨基化的微球置于5-10mL無水乙腈溶液中，室溫條件下反應過夜，待用；無水乙腈溶液中含有40-100mmol/L三氯氧磷，40-60mmol/L?2，4，6-三甲基吡啶；

或將含有40-100mmol/L三氯氧磷，40-60mmol/L?2，4，6-三甲基吡啶的無水乙腈溶液以0.001-0.5mL/min的流速泵入步驟1)得到的氨基化整體柱內，反應過夜；

3)將50-100倍微球或整體柱體積的水加入步驟2)得產物中，使其充分水解；

4)將水解后的微球用醋酸或三氟乙酸調至pH?2-3，而后加入100mmol/L的EDTA溶液，比例為1g/5-10mL，震蕩1-2小時，離心，棄去上清液，沉淀用水洗滌3-5次，真空干燥；

或將pH?2-3的醋酸或三氟乙酸溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5mL/min，時間30-60分鐘，然后將100mmol/L的EDTA溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5mL/min，時間30-60分鐘，再用水以0.001-0.5mL/min的?流速沖洗整體柱30-60分鐘；

5)將步驟4)得到的產物與鋯離子或鐵離子溶液以1∶50-1∶100的g/mL比例加入含有100-200mmol/L鋯或鐵離子的質量濃度10％的醋酸溶液，放置過夜；離心，棄去溶液部份，再用質量濃度10％的醋酸溶液洗滌3次，真空干燥，即可得固定化金屬的親和色譜固定相。

3.按照權利要求2所述的固定化金屬親和色譜固定相的制備方法，其特征在于：所述氨基化試劑為氨水、3，3-二氨丙基亞胺、乙二胺或1，6-二氨基己烷。

4.一種權利要求1所述的固定化金屬親和色譜固定相在磷酸化肽段的分離、富集與純化中的應用，其特征在于：具體操作使用所述固定相時，將固定化金屬親和色譜固定相與蛋白樣品以重量比為100-200∶1混合，孵育30分鐘，洗滌去除非磷酸化肽段，最后用質量濃度為12.5％的氨水洗脫。?