[發明專利]一種新的植酸酶的克隆和表達

有效

• 申請號: 200680054340.6
• 申請日: 2006-04-30
• 公開（公告）號: CN101426907A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發明（設計）人: 姚斌;羅會穎;黃火清;王亞茹;袁鐵錚;史秀云;柏映國;孟昆;楊培龍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N9/52;C12N15/55;C12N15/63;C07K14/195;C12P21/00;A23K1/165;C12R1/01
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司
• 代理人: 楊小蓉

技術領域

本發明涉及一種植酸酶基因、該基因編碼的植酸酶蛋白，生產該植酸酶的中間型耶爾森菌，一種在宿主細胞(如畢赤酵母)表達植酸酶的方法，以及把該植酸酶作為一種有效成分的飼料添加劑。此外，本發明還提供了一種從目標生物體簡單而快速的分離植酸酶基因方法。?

背景技術

植酸磷的含量占動物日糧中總磷50-70％。然而，單胃動物如雞和豬，缺乏從植酸分子水解釋放無機磷的消化酶，以致磷的利用率非常低。沒有被消化的植酸磷，通過消化道被排出體外。這導致對土地和水資源的增加的磷生態負擔。此外，由于植酸螯合幾個必要礦物質，抑制礦物質吸收。總之，在消化道中植酸降低食物的營養價值和飼料的利用率。?

顯然，磷(P)是一個必要的生長元素，所以無機磷(如磷酸氫鈣，脫氟磷酸三鈣)或動物產品(如肉骨粉，魚粉)被添加到動物飼料中，以滿足動物對磷的營養需要。但是這些添加的成分都很昂貴。?

植酸(肌醇六磷酸)是谷類食品或飼料中磷的主要儲存形式。植酸酶，是一類水解磷酸單脂鍵的磷酸酶，它能夠從植酸中水解釋放無機磷，植酸是P在谷物和飼料中的主要儲存形式(E?Graf?et?al.1987)。植酸酶廣泛分布于植物、動物和微生物。基于不同來源的植酸酶的特征的分析，微生物植酸酶正越來越多的受到關注。并且，微生物來源的植酸酶作為飼料添加劑，添加到典型的單胃動物日糧中，已經明顯的提高了植酸磷的營養利用率(Cromwell，et?al，1993)。其結果是降低了動物飼料中無機磷的補充量，同時降低了排泄物中的磷的含量(Kornegay，et?al，1996)。隨著基因工程技術的發展，一方面，越來越多的微生物菌植酸酶已被分離和/或純化。例如，“Purification?and?Characterization?of?a?Phytase?from?Klebsiella?terrigena”，(Greiner?et?al.Arch?Biochem?Biophys.1997?May?15；341(2)：201-6)，“Purification?and?properties?of?a?thermostable?phytase?from?Bacillus?sp.DS11”(Kim?et?al.Enzyme?Microb?Technol，1998Jan，22(1)，2-7)，“Isolation?and?characterization?of?a?phytase?with?improved?properties?from?Citrobacter?braakii”(Kim?et?al.Biotechnol?Lett.2003?Aug；25(15)：1231-4)，“Gene?cloning，expression?and?characterization?of?novel?phytase?from?Obesumbacterium?proteus”(Zinin?et?al.FEMS?Microbiol?Lett.2004?Jul?15；236(2)：283-90)；另一方面，通過定點突變或基因改組，常規植酸酶的性能改良也取得了一定進展。例如；“植酸酶phyA-m基因結構延伸突變改善酶的熱穩定性”(陳惠等，生物工程學報，2005年11月，21卷6期，983-987)，或者“Site-directed?mutagenesis?of?Escherichia?coliphytase”(US?patent?6,841,370，Lei?XG，2005)。這些取得的成果使得植酸酶的生產成本有了很大程度的降低。因為這些優勢，一些已知的植酸酶在飼料工業上得到廣泛應用。?

但是，在這些已廣泛使用的植酸酶中，仍然存在著一些缺陷。因為這些植酸酶作為飼添加劑，并不能發揮它的理想作用。例如，大部分植酸酶在飼料制粒加工的過程中就已經高溫變性失活了，所以在腸道中不能發揮降解植酸的作用。其原因因酶不同而不同。主要是由于，這些酶的穩定性比較差(pH穩定性、熱穩定性、抗蛋白酶降解的穩定性以及在儲存運輸過程中的穩定性)和在胃腸道環境中活性比較低的緣故。?

由于目前使用的植酸酶存在的這些缺陷，因此，人們希望能夠找到這樣一種新的植酸酶：其具有非常好的穩定性，在動物胃腸道中有非常高的活性，并且該植酸酶還能夠通過發酵技術大量生產，這樣可以使其成本大幅度的降低，從而能夠進一步推廣該植酸酶的使用。?