[發明專利]用于分級和富集化學分析中分析物的方法和設備

無效

• 申請號: 200680051573.0
• 申請日: 2006-12-08
• 公開（公告）號: CN101360818A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發明（設計）人: 瑞安·布雷梅爾;弗洛里亞·鄭;埃里克·克勞德;卡梅倫·洛珀;克雷格·毛奇;拉爾夫·S·保羅;羅恩·威爾遜
• 申請（專利權）人: 蛋白質發現公司
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司
• 代理人: 王玉雙

技術領域

本發明涉及質譜分析法(MS)，具體來說，涉及生物樣品如人血清中分析物的預富集和純化，以便用于基質輔助激光解吸電離質譜(MALDIMS)分析。

背景技術

質譜分析法允許同時監控多個分析物，與之相比大多數其他分析技術在同一時間僅能檢測一個或最多才幾個不同的分子。質譜分析法中的最新進展，例如低成本儀器、改善的使用便利性以及高通量MALDI方法，保證了臨床研究的徹底變革，并因此保證了整個醫療衛生產業。然而，實現此種巨大潛力的關鍵在于研發能夠快速、可再現地制備用于質譜分析的復雜生物樣品的樣品制備新技術。此種技術需要適用于多種樣品，所述樣品包括包含固體的組織均漿、全組織切片或其他固體組織制品以及液體樣品(例如全血、血漿、血清、腦脊髓液、唾液、尿等)。血清也許是臨床上最重要的生物液體，每年由真空管采集無數的樣品用于醫療診斷。血液和淋巴液是疾病生物標志物的充足來源，因為除了在血液和淋巴液中循環的天然血源性蛋白質和多肽外，體組織還向血液和淋巴液中釋放其它的細胞成分。因此這些循環的液體含有包括蛋白質和多肽(PP)的疾病生物標志物，所述蛋白質和多肽是病理狀態(例如細胞增生、壞疽、下垂癥、細胞凋亡或腫瘤組織抗原的脫落)的標示。在本文中，術語PP用于表示寬范圍分子量的寡肽或蛋白質，所述寬范圍分子量包括從兩個或多個氨基酸(即大約200道爾頓)到大分子量蛋白質(大約1百萬道爾頓或更多)的范圍。

血清中一類特別有前途的疾病標志是低分子量(low?molecular?weight，LMW)PP片段，其豐度和結構變化可指示出多種(如果不是最多的話)人類疾病。LMV血清蛋白質組由多種生理學上重要的多肽，例如細胞因子、趨化因子、肽類激素以及較大蛋白質的降解片段組成。這些降解來源的肽已經顯示出與例如癌癥、糖尿病和心腦血管和傳染性疾病的病理狀態有關。然而分析低分子量血清蛋白質組需要制備大量的樣品并且由于在血清蛋白質總量中占優勢的、高比例(大約55％)白蛋白的存在使得分析難以進行。存在的問題還有其他LMW?PP分子豐度的大范圍變化，以及主要糖蛋白的巨大不均勻性。例如，當前臨床測量的最稀有的蛋白質以低于白蛋白超過10個數量級的濃度存在。但是這些稀有的蛋白質和多肽可以代表高敏感性和選擇性的疾病標志和潛在的藥物靶點。

傳統上，液相色譜(LC)或基于親和度的方法通常適用于血清成分的分離。采用LC方法的純化包括將連接分子以化學方式附著于LC柱內的固定相上(產生功能化的固定相)。一旦樣品裝載入柱內，流動相流過固定相。每個分析物結合在固定相上而不是在流動相中花費的時間的分級確定了不同分析物(以及雜物和干擾物)穿過LC柱的相對位移速度，這用于分析物的純化。例如，目標分析物分子(例如多肽和蛋白質)可以被吸附在功能化的固定相上，與此同時雜物自柱中洗脫。隨后，調整流動相以便將目標分子從功能化的固定相中釋放。通常，與MALDI-MS相容的揮發性緩沖劑，例如乙腈/水混合物，在此步驟中用作流動相。用這種方式，將純化的目標分子自LC柱中洗脫并且收集以進行MALDI-MS分析。此處樣品相對地不包含會干擾和限制分析靈敏度的鹽和其他雜物。但是，這些方法十分耗時并且不能用作高通量方法。

因此需要改良用于在高通量分析方法中分離、富集和添加分析樣品所需試劑的設備和程序。用于質譜分析法的樣品制備技術的最近綜述表明了這些方法仍然是耗時、煩瑣、需要高水平實驗員，并且難以自動化。因此，在任何一個臨床研究中可以分析的樣品數目十分受限，從而嚴重妨礙統計學意義程度并因此妨礙了這些研究的臨床意義。因此，由于缺少高通量樣品制備系統，作為用于人以及其他動物的疾病、疾病治療和基因表達分析的生物標志物(可以由質譜分析法檢測)來源的大量LMW血清蛋白質組沒有得到開發。

對沉積在MALDI靶板上的樣品進行基質輔助激光解吸電離質譜(MS)分析正快速地成為用于分析蛋白質、多肽和其他生物分子分析的選擇方法。MALDI-MS是十分靈敏的分析方法并且可能是與生物鹽和pH緩沖液最相容的MS法。此外，其可高效率地從亞皮摩爾(sub-picomole)數量級的生物大分子中產生高質量離子的能力使得此技術對于大分子分析十分有用。但是，在天然生物樣品(例如血液、血漿或血清)中肽分析物的分析對于質譜分析法分析提出了以下所述的特殊的問題。