[發(fā)明專利]反應容器及DNA的擴增反應方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680051112.3
• 申請日: 2006-01-20
• 公開（公告）號: CN101360819A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發(fā)明（設計）人: 佐藤里佳;植山公助
• 申請（專利權(quán)）人: 凸版印刷株式會社;株式會社島津制作所;獨立行政法人理化學研究所
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N15/09;C12Q1/68
• 代理公司: 隆天國際知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 高龍鑫

技術領域

本發(fā)明涉及適于生物體反應的一次性容器。例如，涉及一次性反應容器，其可適用于，采集含有來自人體的微量DNA的樣品，使其進行PCR擴增并檢查其單核苷酸多態(tài)性。

背景技術

單核苷酸多態(tài)性(SNP)，表示在DNA序列中單堿基被其他的堿基置換，由于該單堿基的不同，產(chǎn)生個人的個體差異，即易患病度、所開藥劑的種類和效果以及副作用等上的差異。因此，為在遺傳基因水平上對其體質(zhì)進行檢查并且對每種體質(zhì)決定治療方針和預防方針，此SNP的檢查受到關注。

作為使用于該檢查的DNA，例如，利用從人體采集的血液等樣品中所包含的DNA，但是為了使采集的血液等樣品少量即可，并有效率地進行檢查，通過使采集的樣品中的DNA擴增且檢查擴增后的DNA，來檢知所述SNP。

對于擴增樣品中所包含的微量DNA的方法來說，已知有各種方法，其中PCR法作為代表性的方法被公知。該方法，將樣品中的雙鏈DNA的變性階段(生成單鏈DNA)、退火階段(將被稱為引物的寡聚核苷酸和單鏈DNA的一部分進行雜交)、以及延伸階段(以所述引物作為起點使核苷酸延伸)所構(gòu)成的三個階段作為一個循環(huán)、并且反復進行該循環(huán)使樣品中的DNA擴增。在理論上，循環(huán)數(shù)作為n，則可擴增至2ⁿ倍。變性階段在80～100℃進行，退火階段在50～60℃進行，而延伸階段在60～80℃進行。一個循環(huán)所需要的時間最多為10分鐘左右，但是為了反復進行該循環(huán)擴增必要量的DNA，則也有花費數(shù)小時的情況。

另外，擴增獲得DNA被用于此DNA中所包含的SNP的檢查階段(分型階段)。分型方法有多種，其中侵入法作為代表性的方法被例舉。在該方法中，使用兩種非熒光標記寡聚核苷酸(等位基因探針(Allele?probe)、侵入探針(Invader?probe))、一種熒光標記寡聚核苷酸(FRET探針)以及對DNA結(jié)構(gòu)特異性的核酸內(nèi)切酶(裂解酶)。等位基因探針為5’端具有與模版DNA的序列不相關的序列(標簽(フラツプ))、3’端具有相對模版DNA特異性的互補序列的寡聚核苷酸，其互補序列的5’端末端成為SNP部分。另一方面，侵入探針被設計，以從所述SNP部分開始與模版DNA的3’端互補性地結(jié)合。另外，F(xiàn)RET探針為具有熒光標記的寡聚核苷酸，在其5’末端具有熒光標記(報告基團(Reporter))，在其上游結(jié)合猝滅基團(Quencher)。并且，從報告基團開始3’端的部分進行自體雜交并構(gòu)成雙鏈，從該雙鏈開始在3’末端側(cè)具有與等位基因探針的標簽呈互補序列的單鏈的部分。另外，裂解酶為識別核苷酸的三層重疊的部分、切斷三層重疊的核苷酸的3’端并使其游離的酶。

另外，在該侵入法中，首先，在將檢查對象的模版DNA和等位基因探針進行雜交后時，侵入探針的3’末端侵入SNP部分。因此，在該SNP部分，模版DNA、等位基因探針以及侵入探針相重疊形成三層結(jié)構(gòu)。裂解酶識別該SNP部分的結(jié)構(gòu)，使等位基因探針的標簽切斷或游離。然后，來自等位基因探針的所述游離標簽與FRET探針進行雜交。通過雜交，在自體雜交的雙鏈和來自等位基因探針的所述游離標簽的交點形成三層結(jié)構(gòu)，裂解酶再次識別此結(jié)構(gòu)并切斷FRET探針的報告基團，而從猝滅基團上被放開。然后，通過利用激發(fā)光進行照射，被切斷游離的報告基團的熒光標記進行熒光顯色。如果SNP部分的堿基與等位基因探針不相配，則不切斷或游離來自等位基因探針的標簽，因而，由于熒光發(fā)光率非常低，通過檢出該熒光強度的差，可以檢查SNP。另外，一般利用紫外光或者可視光作為激發(fā)光。

上述的DNA的檢查技術提出了以下方法(JP特開平05-317030號公報)：即，由于污染(contamination)而使得其檢查精度降低，因而使用一次性反應容器，在基板上設置多個凹部以分別作為收容室、反應室及檢查室，在收容室內(nèi)收容必要的試劑，同時在反應室使用該試劑等進行PCR擴增反應，在檢查室進行分型(typing)反應。通過該方法，由于可在一次性反應容器中完成單一的檢查對象的檢查，可防止污染而進行正確地檢查。

專利文獻1：JP特開平05-317030號公報

發(fā)明內(nèi)容

然而，如前所述，PCR擴增反應需要在80～100℃的范圍反復進行熱循環(huán)，并且為了能夠獲得必要量的DNA需花費數(shù)小時。在這種進行長時間加熱的情況下，DNA和試劑蒸發(fā)，反而使其減量，從而出現(xiàn)不能獲得必要量的DNA的情況。

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種防止這些DNA和試劑蒸發(fā)且能夠獲得必要量的DNA的一次性反應容器和利用該反應容器的擴增反應方法。