[發(fā)明專利]將融合多肽遞送入細(xì)胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680050497.1
• 申請日: 2006-11-03
• 公開（公告）號: CN101355957A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李尚揆;李承揆;崔濟(jì)民
• 申請（專利權(quán)）人: 為人技術(shù)株式會社
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61P29/00;A61P37/06
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 康健;林曉紅

發(fā)明背景

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及將生物分子轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物(BTC)諸如融合多肽遞送入細(xì)胞的 方法。所述生物分子轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物(BTC)包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)和目的 分子，諸如多肽。

背景技術(shù)

通常，大分子諸如蛋白和核酸不能透過活細(xì)胞。僅僅小分子可以非常 低的速率透過活細(xì)胞膜限制了開發(fā)利用大分子諸如蛋白和核酸來治療、預(yù) 防或診斷疾病的藥物的研究。因此，將生物活性大分子有效轉(zhuǎn)導(dǎo)入活細(xì)胞 的細(xì)胞液和細(xì)胞核而不會造成有害的副作用的方法是非常需要的。

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)已經(jīng)被用于遞送生物活性分子(Viehl?C.T.，et?al.， Ann.Surg.Oncol.12：517-525(2005)；Noguchi?H.，et?al.，Nat.Med.10：305-309 (2004)；和Fu?A.L.，et?al.，Neurosci.Lett.368：258-62(2004))。但是沒有試圖利 用PTD遞送受體蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。也沒有試圖經(jīng)鼻內(nèi)遞送載有生物活性 分子的PTD。

CTLA-4(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原-4)是的活化誘導(dǎo)的T細(xì)胞表面分子， 對于T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)控是必需的。其結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的B7-1 或-2，其親和力高于T細(xì)胞活化的正輔助性刺激分子CD28的親和力10-到 20-倍(Ngoc?L.P.，et?al.，Curr.Opin.Allergy?Clin.Immunol.5：161-166(2005)； Noel?P.J.，et?al.，Adv.Exp.Med.Biol.406：209-217(1996)；和Perkins?D.，et?al.， J.Immunol.156：4154-4159(1996))。

發(fā)現(xiàn)含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)的CTLA-4胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域在不 同物種之間100％保守，提示該區(qū)域?qū)τ贑TLA-4通過螯合細(xì)胞內(nèi)信號分子 對T細(xì)胞活化進(jìn)行負(fù)調(diào)控是重要的(Ravetch，J.V.&Lanier，L.L.，Science 290：84-89(2000)；和Jay，C.U.&Jie，J.，Curr.Opin.Immunol.9：338-343 (1997))。因此，CTLA-4的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是開發(fā)哮喘、自身免疫性疾病以及 移植物排斥的免疫治療藥物而言非常好的細(xì)胞靶。目前，利用PTD將受體 蛋白具體是CTLA-4遞送進(jìn)入細(xì)胞是困難的。我們現(xiàn)在已經(jīng)顯示通過將僅 僅受體蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與PTD融合來遞送CTLA-4作為PTD貨物(cargo) 的方法。CTLA-4的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨罨腡細(xì)胞是特異性的，所以在用 作PTD的貨物蛋白時，其克服了陽離子PTD組織特異性的缺乏導(dǎo)致的其 體內(nèi)應(yīng)用的限制。

發(fā)明簡述

本發(fā)明的一個目的是提供抑制患有自身免疫性疾病或炎性疾病的脊椎 動物中的T細(xì)胞活化的方法，包括給藥所述脊椎動物治療有效量的包含蛋 白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和受體蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的融合多肽。

本發(fā)明的另一目的是提供將生物分子轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物(BTC)遞送給氣管或 肺細(xì)胞的方法，包括經(jīng)鼻內(nèi)給藥生物分子轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物到脊椎動物。生物分 子轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)和目的分子。

另一優(yōu)選實施方案是利用特異于活化T細(xì)胞的CTLA-4胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 (SEQ?ID?NO：11)作為PTD的貨物蛋白。利用PTD-ctCTLA-4融合蛋白克服 了由于陽離子PTD的組織特異性缺乏導(dǎo)致的其體內(nèi)應(yīng)用的限制。

本發(fā)明使得能夠開發(fā)新的治療蛋白藥劑，其包含具體蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo) 結(jié)構(gòu)域，諸如Hph-1，其具有高度細(xì)胞或組織特異性。本發(fā)明還使得能夠經(jīng) 由局部給藥途徑給藥產(chǎn)生的融合多肽，從而最小化或避免系統(tǒng)副作用，諸 如行為異常，細(xì)胞毒性和免疫原性。

附圖簡述

圖1A顯示Hph-1-PTDβ-gal或eGFP綴合的融合蛋白的結(jié)構(gòu)。Hph-1- PTD是11個氨基酸的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(YARVRRRGPRR)(SEQ?ID?NO：1)， 從人轉(zhuǎn)錄因子Hph-1鑒定。

圖1B是通過Western印跡分析的培養(yǎng)的Jurkat(E6.1)細(xì)胞中Mph-1- β-gal的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和動力學(xué)的照片。