[發(fā)明專利]蛋白功能的體外分子進化方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200680050127.8 | 申請日： | 2006-11-17 |
| 公開（公告）號： | CN101351553A | 公開（公告）日： | 2009-01-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | K·哈拉爾德松;M·卡爾松;A－C·M·哈格爾;C·菲雷布林;F·卡爾松;P·埃爾馬克 | 申請（專利權(quán)）人： | 鱷魚生物科學(xué)公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 北京戈程知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 | 代理人： | 程偉 |
| 地址： | 瑞典*** | 國省代碼： | 瑞典;SE |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 蛋白 功能 體外 分子 進化 方法 | ||
1.用于從母多核苷酸序列產(chǎn)生多核苷酸序列或序列的群體的方法，該 方法包括下述步驟
(a)提供多核苷酸分子的第一群體和多核苷酸分子的第二群體， 第一和第二群體共同組成母多核苷酸分子的正鏈和負(fù)鏈；
(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群體以生產(chǎn)多核苷 酸片段；
(c)將產(chǎn)生自正鏈的所述多核苷酸片段與產(chǎn)生自負(fù)鏈的片段在允 許片段退火的條件下接觸；和
(d)擴增退火到彼此的片段以產(chǎn)生至少一條其序列不同于母多核 苷酸分子的多核苷酸分子
其中通過加入一條或更多條具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸控制在 步驟(d)中生產(chǎn)的至少一條多核苷酸分子的選擇區(qū)域內(nèi)的序列變異性 程度，該寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子的3’和5’末端核苷酸間 但排除3’和5’末端核苷酸的序列上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中母多核苷酸編碼一個或更多個蛋 白基序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中多核苷酸的第一和第二群體 是cDNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多核苷酸的第一和第二群體是單 鏈的。
5.根據(jù)上權(quán)利要求1所述的方法，其中多核苷酸的第一群體由母多核 苷酸序列的正鏈組成，多核苷酸的第二群體由母多核苷酸序列的負(fù)鏈 組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將多核苷酸的第一和第二群體單 獨地在步驟(b)中進行消化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)中的核苷酸酶是外切 核酸酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中外切核酸酶選自BAL31、外切核 酸酶I、外切核酸酶V、外切核酸酶VII、外切核酸酶T7基因6、細(xì)菌 噬菌體λ外切核酸酶或外切核酸酶Rec?Jf。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(d)中生產(chǎn)的至少一條 多核苷酸序列的改變的氨基酸序列與編碼的多肽的改變的性質(zhì)相關(guān)。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在步驟(b)之前或在步驟(b) 中加入具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸，且其中核酸酶特異于單鏈多核 苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(b)后步驟(c)前加 入具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 與母多核苷酸序列的內(nèi)部序列分享至少90％的序列同一性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 與母多核苷酸序列的內(nèi)部序列分享95％的序列同一性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 具有單條核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 具有至少兩條不同的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 是母多核苷酸序列的相同內(nèi)部序列的變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 與母多核苷酸的至少兩個不同區(qū)域分享至少95％序列同一性或是其變 體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過易錯PCR或使用寡核苷酸 合成儀生產(chǎn)具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 的長度介于10和500個核苷酸間。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中具有預(yù)決的變異性的寡核苷酸 的長度介于50和200個核苷酸間。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中母多核苷酸序列編碼配體。
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