[發明專利]結合層及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 200680047752.7
• 申請日: 2006-06-21
• 公開（公告）號: CN101341409A
• 公開（公告）日: 2009-01-07
• 發明（設計）人: 沙伊·尼邁里
• 申請（專利權）人: 生物輻射海法有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁業平;張天舒

技術領域

本發明總體上涉及用于生物測定和生物傳感器的結合層和基質。

背景技術

人們已經開發了生物傳感器來檢測包括寡核苷酸在內的各種生物 分子復合物、抗體-抗原的相互作用、激素-受體的相互作用以及酶-底物 的相互作用。通常來說，生物傳感器由兩個部件構成：高特異性的識別 元件和將分子識別結果轉化為可量化的信號的轉換器。這種信號的轉化 可以通過許多方法來完成，包括熒光法、干涉測量法和重量測量法。

直接法不需要使用熒光化合物對待分析物進行標記，由于采用該方 法分析相對簡便，并且可以研究小分子與不易被標記的蛋白質之間的相 互作用，因此令人感興趣。直接光學法包括表面等離子體共振法(SPR)、 光柵耦合器法、橢圓偏振測量法、倏逝波裝置法和反射測定法。這些檢 測方法的理論上預測的檢測限已經得到確定并經過試驗證實可以用于 檢測相關的濃度范圍。

在對生物分子復合物或相互作用進行實時研究時，通常使被固定的 (例如，通過化學結合層而連接在傳感器芯片表面上的)配體分子與待 分析物分子接觸。由此使它們發生相互作用，并通過一種或多種上述的 檢測方法來監測該相互作用。由于這種研究的效率主要取決于配體分 子，因此能夠有效地使配體分子得到固定通常是基本的和最關鍵的要 求。配體分子的密度高可以使與其反應的待分析物分子的數量增加，從 而可以提供一種具有更低檢測限的更靈敏的測定方法。

除了被固定的配體的量以外，另一個重要的方面是配體在連接到傳 感器芯片表面上后仍然保持其生物活性。保持高的配體活性就可以保證 大量的待分析物分子能夠與配體發生相互作用，從而獲得更靈敏的分 析。配體活性強烈地取決于結合層的生物相容性，以及固定方法和固定 過程中的各種參數。

在研究大分子(例如蛋白質)與小分子之間的相互作用時，特別需 要對分析的靈敏度進行改善，然而由于蛋白質配體與小的待分析物分子 之間尺寸的差別，導致所得到的信號可能相對較弱。這種生物測定在藥 物發現領域中具有特殊的重要性，在該領域中經常對小的靶分子在大的 蛋白質類受體上的結合情況進行測定。

一種用于將配體分子連接到傳感器芯片表面上的最為人們接受的 方法是基于使用含有羧基(CG)的結合層的方法，其中所述羧基以酸 的形式和/或相應的羧酸鹽的形式存在。所述羧基(CG)通常被活化從 而形成具有反應活性的酯，然后該具有反應活性的酯與配體分子的親核 性基團反應(主要與伯胺基反應)從而形成酰胺共價鍵。最通常使用的 活化溶液為由水溶性的碳二亞胺的混合物所構成的溶液，最常使用N- 乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)，來形成具有反應活性的NHS酯。歐洲專利No.1343010教 導了一種可供選擇的、不常用的方法，其中使用N-羥基硫代琥珀酰亞 胺(硫代NHS)代替NHS。

在各種類型的這樣的結合層中，市售可得的生物傳感器中經常使用 的層為基于羧甲基葡聚糖(CMD)的層，例如專利文獻No.WO?09221976 和US?5436161中所教導的羧甲基葡聚糖的層，以及科技文獻例如J. Chem.Soc.Chem.Commun.1990，1526-1528和Anal.Biochem.1991， 198，268-277中所描述的羧甲基葡聚糖的層。據報道，使用標準活化溶 液最多可以將這種層中的30％-40％的羧基活化為NHS酯。另外，已經 表明，CMD層通常只結合部分量的蛋白質，這些蛋白質通過靜電作用 而被吸附到CMD層上。在某些情況中，對于要分析相互作用的測試來 說，這種結合能力實際上是不夠的。

從另一個方面來看，已經證實，由于存在沒有被活化的羧基，所以 活化后的層帶有凈量的負的靜電電荷。已經知道，在經過常規的滅活步 驟(其中活性基團與乙醇胺反應從而形成中性的酰胺)后依然殘留有這 種電荷。正如本領域技術人員所了解的那樣，由于帶電荷的待分析物分 子可能與該層發生非特異性地相互作用，從而可能導致分析結果被干擾 和失真，所以在相互作用分析階段中不期望在結合層中殘留有電荷。