[發明專利]對映選擇性環氧化物水解酶和用其制備對映純環氧化物的方法

有效

• 申請號: 200680046194.2
• 申請日: 2006-10-04
• 公開（公告）號: CN101522892A
• 公開（公告）日: 2009-09-02
• 發明（設計）人: 金尚珍;姜成均;黃英玉;禹正熙;曺章天;姜智賢;權改勁
• 申請（專利權）人: 韓國海洋研究及發展院
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12P41/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 劉 冬;黃可峻

發明領域

本發明涉及對映選擇性環氧化物水解酶和用對映選擇性環氧化物水解酶水解各種環氧化物底物從而制備具有對映純活性的環氧化物的方法。?

發明背景?

很多生物活性物質如藥物以不同的對映體形式存在，只有特定的對映體才具有所需功效，其余的對映體會導致嚴重的不良反應。在安全性和生物活性方面，必須得到單一對映體，因此，可對合成對映純生物活性物質進行許多研究。?

對映純環氧化物和鄰二醇為制備對映純生物活性化合物如藥用化合物、肽類和功能性食品的通用合成中間體(Grogan，et?al.，FEMSMicrobiol.Lett.，141：239-243，1996；Arahira，et?al.，Eur.J.Biochem.，267：2649-2657，2000)，因為這些化合物具有優良的反應性并可誘導各種反應。?

特別地，可用手性化學催化劑和酶制備對映純環氧化物，只有單一對映體是通過用環氧化物水解酶進行選擇性水解得到外消旋底物中的各個對映體來制備的。在不久的將來，該方法可被用于商業，因為其可將廉價的外消旋底物變為具有高附加值的對映純環氧化物。環氧化物水解酶只對映選擇性地將外消旋環氧化物底物中的(R)或(S)-對映體水解為二醇而剩下其他類型的對映體，從而得到對映純環氧化物。此外，環氧化物水解酶對(R)或(S)-對映體的對映選擇性取決于微生物和底物結構。?

環氧化物水解酶(EHase；EC?3.3.2.3)為常見的酶，已從各種來源如細菌、酵母、真菌、昆蟲、植物和哺乳動物中分離(Weijers，et?al.，J.Mol.Catal.B?Enzym.，6：199-214，1999；Archelas，&Furstoss，Curr.Opin.Chem.Biol.，5：112-119，2001)。由于在通過對映選擇性EHase的動力學拆分來制備對映純環氧化物中的潛在應用，已對幾種EHase進行研發(Tokunaga，et?al.，Science，277：936-938，1997)。?

但是，對映選擇性EHases的數量有限，這需要研究開發新型對映選擇性EHases用于在藥學工業中制備對映純環氧化物。?

大多數EHases為α/β水解酶家族成員，該家族包括蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脫鹵素酶和過氧化物酶(Nardini，&Dijkstra，Curr.Opin.Struct.Biol.，9：732-737，1999；Rick，et?al，.J.Am.Chem.Soc.，121：7417-7418，1999)。α/β區域由被α螺旋環繞的核心—平行或混合β層構成。這些酶的特征為采用兩步機理，其中酶的催化親核部分先進攻共價中間體的極性親電底物，然后再將其水解(Yamada，et?al.，J.Biol.Chem.，275：23082-23088，2000)。α/β水解酶折疊酶的保守催化三元體(triad)由親核殘基(Asp或Ser)、酸性殘基(Asp或Glu)和保守組氨酸殘基構成。親核基團適合保守的氨基酸序列基序，Sm-X-Nu-Sm(Sm＝小殘基，X＝任何殘基，Nu＝親核基團)。其它保守的氨基酸序列為包含酶的含氧的陰離子洞(oxyanion?hole)的HGXP基序(Ollis，et?al.，Protein?Eng.，5：197-211，1992)。?

但是，EHases中—級序列的保守性僅限制在關鍵區域的2或3個氨基酸，這使得通過同源檢索進行篩選比較困難。?

發明簡述?

本發明的發明者通過篩選來自各種海洋環境的赤細菌(Erythrobacter?sp.)、鞘氨醇細菌(Sphingopyxis?sp.)、新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium?sp.)和紅細菌(Rohdobacterium?sp.)，分析它們基因?組的ORF序列確定候選基因，并表達候選基因發現了具有高對映選擇性水解活性的環氧化物水解酶。?

本發明的目的為提供來自海洋環境的可產生高對映純環氧化物的對映選擇性環氧化物水解酶蛋白。?

本發明的另外的目的為提供通過采用對各種環氧化物底物具有高對映選擇性的環氧化物水解酶蛋白制備對映純環氧化物的方法。?