[發明專利]用于制備L－甲硫氨酸的微生物和方法

無效

• 申請號: 200680038488.0
• 申請日: 2006-10-23
• 公開（公告）號: CN101291590A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: O·策爾德爾;A·赫羅爾德;C·克洛普羅格;H·施羅德;S·哈夫納;E·海因茨勒;C·維特曼;J·克勒默;J·G·佩羅;R·R·約卡姆;T·A·帕特森;M·威廉姆斯;T·赫爾曼
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: A23K1/00
• 分類號: A23K1/00;C12P13/12;C12N15/52
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;隗永良

發明領域

本發明涉及用于有效制備L-甲硫氨酸的微生物和方法。具體地，本發 明涉及微生物和方法，其中甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累被 減少和/或防止。

背景技術

當前，世界上每年甲硫氨酸產量為約500,000噸。甲硫氨酸是家畜或 家禽飼料中第一種限制氨基酸，并且由于該原因，主要作為飼料補充劑應 用。與其他工業氨基酸相比，甲硫氨酸幾乎只作為通過化學合成產生的外 消旋物應用。因為動物可以代謝甲硫氨酸的兩種立體異構體，所以直接喂 飼化學方法生產的外消旋混合物是可能的(D′Mello和Lewis，Effect?of Nutrition?Deficiencies?in?Animals：Amino?Acids，Rechgigl(Ed.)，CRC Handbook?Series?in?Nutrition?and?Food，441-490，1978)。

然而，在通過生物技術方法代替現有的化學生產中仍然存在很大興趣。 這是由于在較低水平的補充時，L-甲硫氨酸是比D-甲硫氨酸更好的含硫氨 基酸來源(Katz和Baker，(1975)Poult.Sci，545，1667-74)。此外，化學方法 使用相對危險的化學品并且產生大量廢物流。化學生產的所有這些缺點都 可以通過有效的生物技術方法避免。

對于其他氨基酸，如谷氨酸，已知使用發酵方法生產它們。為了這些 目的，已經證明某些微生物，如大腸桿菌(E.coli)和谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium?glutamicum)尤其合適。通過發酵產生氨基酸具有僅 僅產生L-氨基酸的特別優點。此外，避免了在化學合成中使用的引起環境 問題的化學品，如溶劑等等。然而，通過微生物發酵生產甲硫氨酸將僅僅 是化學合成的備選方案，如果它允許以與化學生產相當的價格在商業規模 上生產甲硫氨酸的話。

所以，通過大規模培養被開發以產生和分泌大量L-甲硫氨酸的細菌生 產L-甲硫氨酸是所希望的目標。該方法的改進可以涉及發酵措施，如攪拌 和提供氧氣，或者營養培養基的組成，如發酵期間的糖濃度，或者例如通 過離子交換層析對產物的處理，或者微生物自身的內在輸出性質。

還使用誘變、選擇和突變體選擇方法來改善這些微生物的輸出性質。 以這種方式得到了耐受抗代謝物或者對于具有調節重要性的代謝物為營養 缺陷的高生產菌株。

重組DNA技術也在幾年來被用于通過擴增個體氨基酸生物合成基因 和研究對氨基酸生產的影響來改進產生L-氨基酸的微生物菌株。

Riickert等人，Journal?of?Biotechnology?2003，104，213-228提供了谷氨 酸棒桿菌中L-甲硫氨酸生物合成途徑的分析。可以證實MetZ(也稱作Met Y)和MetB的已知功能，并且證明MetC(也稱作AecD)是胱硫醚-β-裂合 酶。此外，在該研究中鑒定了催化L-高半胱氨酸向L-甲硫氨酸轉化的MetE 和MetH。

WO?02/097096使用來自棒桿菌細菌的核苷酸序列，其編碼McbR抑 制基因(也稱作MetD)，和使用細菌制備氨基酸的方法，在所述細菌中 MetD抑制基因被減弱。根據WO?02/097096，該轉錄調節子McbR的減弱 提高了棒桿菌細菌中L-甲硫氨酸的產量。在WO?02/097096中還描述除了 減弱McbR抑制基因外，對于L-甲硫氨酸的制備優選增強或過表達編碼胱 硫醚-γ-合酶的MetB基因。

特定分子產量提高的菌株的選擇是耗時和困難的方法。因此，仍然非 常需要有效產生L-甲硫氨酸和/或具有顯著增加的L-甲硫氨酸含量的微生 物，其可以用于得到甲硫氨酸化合物。

發明概述

本發明的一個目的是提供在微生物中有效產生L-甲硫氨酸的方法。

本發明的另一目的是提供有效產生L-甲硫氨酸的微生物。

如從說明書將變得顯而易見的是，通過獨立權利要求的主題得到本發 明的這些和其他目標。

本發明的其他實施方案通過從屬權利要求定義。

根據本發明的一個實施方案，提供了用于制備L-甲硫氨酸的微生物， 其中尤其在甲硫氨酸途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累被減小和/或防止。 L-甲硫氨酸的生物合成途徑中高羊毛氨酸的形成和/或積累的這種減小和/ 或防止使得微生物可能產生和分泌大量希望的分子，即L-甲硫氨酸。