[發明專利]結合GLA結構域的人FVⅡ單克隆抗體及其應用

無效

• 申請號: 200680031312.2
• 申請日: 2006-08-31
• 公開（公告）號: CN101253197A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: H·K·平格爾;E·M·尼科拉森;J·克拉魯普
• 申請（專利權）人: 諾沃－諾迪斯克保健股份有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K16/36
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 程淼;梁謀

發明領域

本發明涉及新型抗FVII抗體，其在測定樣品中正確折疊且完整的FVII的數量上以及在純化和工藝優化上的應用。

發明背景

對于蛋白的工業生產，能夠以方便且容易的檢測法來測定樣品中FVII多肽的濃度是令人期待的。進行這一測定的一種方法是通過特異性抗體，該特異性抗體將結合到FVII多肽上并且隨后能夠通過結合酶的酶促反應而被量化。用這一酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測樣品中的特定蛋白是本領域眾所周知的。“夾心”ELISA對于更準確地測定抗原濃度非常有用，在該測定中，樣品中抗原的絕對數量將被測定并且可以得到抗原標準。

為利用這一檢測法，將一種抗體(“捕捉”抗體)純化并且結合到固相上。然后抗原被加入并被允許與該結合的抗體相絡合。然后通過洗滌除去未結合的產物，并且使得標記的二抗(“檢測”抗體)與抗原結合，從而完成了“夾心”。然后使用比色底物，通過測量結合到基質上的標記的二抗數量來量化該檢測。這一技術的主要優點在于抗原不需要在使用前被純化，并且這些檢測也是非常特異性的。然而，并非所有抗體都可以被使用。單克隆抗體的組合必須符合“配對”，這意味著它們可以識別抗原上的分開的表位。

該夾心ELISA的靈敏度取決于四種因素：結合到固相上的一抗的分子數；一抗對抗原的親和性；二抗對抗原的親和性；二抗的比活性。

尤其是，抗體對抗原的親和性只可以通過被其它抗體的替代而改變。因此，對于特定FVII多肽具有強親和性的抗體是理想的。

許多蛋白為了被活化而需要翻譯后修飾。這些修飾包括前肽的切割以及成熟多肽的正確折疊。

一個特殊的蛋白家族被特有的模塊化組織(characteristic?modularorgamzation)所識別并且其生物合成需要維生素K。氨基末端的膜結合結構域含有γ-羧基化谷氨酸(GLA)殘基，在依賴維生素K的反應中，由羧化酶翻譯后修飾。這些蛋白的γ-羧化影響其正確的折疊并且因此也影響其活性。

在生產屬于該家族的蛋白時，有時需要通過利用免疫親和柱以非常高效的方式純化培養液。另外，為了優化培養物中活性FVII多肽的產量，需要更好地控制培養工藝。通過高效單克隆抗體的鑒定以及測定培養物中目的活性蛋白(被正確加工的：導致形成結構表位的γ-羧化)與FVII多肽總量的比率的簡易快速的檢測法達到了這一目的。因此，該過程可以被監測并被調節到最佳條件，例如允許在培養的最佳時間收獲培養物。

發明內容

在諸如鈣的二價陽離子存在時，對FVII的GLA結構域具有高親和性的特異性單克隆抗體現在已經被鑒定。

這些抗體可以被用于對FVII多肽的有效絕對濃度的測定方法中，并且進一步地，當這些高親和性抗體與識別暴露于FVII多肽上的不同表位的抗體相結合時，產生了一種能夠測定樣品中被正確加工的FVII多肽與總FVII多肽的比率的方法。這一方法可以被用于在生產時優化活性FVII多肽的產率。

另外，當鈣存在時，這些對GLA結構域具有高親和性的新型特異性抗體可以被用于非常有效且簡便的純化方法中。

因此，在廣義方面，本發明涉及抗野生型人類FVII的高效單克隆抗體的鑒定。

本發明的第一方面涉及單克隆抗體，其只在至少0.05mM二價陽離子存在時，與存在于野生型人類FVII的完整γ-羧基谷氨酸(GLA)結構域上的表位相結合。

本發明的第二方面涉及核酸分子，其編碼單克隆抗體，該單克隆抗體只在至少0.05mM二價陽離子存在時，與存在于野生型人類FVII的完整γ-羧基谷氨酸(GLA)結構域上的表位相結合。

再一方面，本發明涉及一種載體，其包括編碼單克隆抗體的核酸分子，該單克隆抗體只在至少0.05mM二價陽離子存在時，與存在于野生型人類FVII的完整γ-羧基谷氨酸(GLA)結構域上的表位相結合。

再一方面，本發明涉及一種細胞，其包括含有編碼單克隆抗體的核酸分子的載體，該單克隆抗體只在至少0.05mM二價陽離子存在時，與存在于野生型人類FVII的完整γ-羧基谷氨酸(GLA)結構域上的表位相結合。

再一方面，本發明涉及測定樣品中包括完整GLA結構域的FVII多肽量的方法，該方法包括下述步驟：

a)在至少0.05mM二價陽離子存在時，將樣品與第一單克隆抗體相接觸，該第一單克隆抗體只在至少0.05mM二價陽離子存在時，與存在于野生型人類FVII的完整γ-羧基谷氨酸(GLA)結構域上的表位相結合，