[發(fā)明專利]肝祖細(xì)胞

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680026672.3
• 申請日: 2006-05-24
• 公開（公告）號: CN101228266A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: M·B·赫雷拉桑徹茨;B·巴索拉蒂;G·卡穆西;S·巴蒂格利里
• 申請（專利權(quán)）人: 弗雷森紐斯醫(yī)療護(hù)理德國有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N5/22
• 分類號: C12N5/22
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 劉冬;劉玥

1.一種非卵圓人肝多能祖細(xì)胞系，其表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記。

2.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記白蛋白和蛋白。

3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記CK18。

4.權(quán)利要求1-3中任一項的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記CD29、CD73、CD146、CD105和CD90。

5.權(quán)利要求1-4中任一項的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系不表達(dá)造血細(xì)胞

6.權(quán)利要求1-5中任一項的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系不表達(dá)造血干細(xì)CD133。

7.權(quán)利要求1-6中任一項的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系不表達(dá)卵圓細(xì)胞D117(C-kit)、CK19和CD34。

8.權(quán)利要求1-7中任一項的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系不表達(dá)成熟肝細(xì)細(xì)胞色素P450，不合成尿素。

9.權(quán)利要求1-8中任一項的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系能夠分化為成熟胞和產(chǎn)胰島素細(xì)胞。

10.權(quán)利要求1-9中任一項的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系是永生化的。

11.一種分離權(quán)利要求1-9中任一項的非卵圓人肝多能祖細(xì)胞系??，所述方法包括以下步驟：

??)在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體肝臟來源的人成熟肝細(xì)胞，直至成熟??死亡，并選擇具有上皮樣形態(tài)的存活細(xì)胞群；

??i)通過在含血清、含葡萄糖、補(bǔ)加hEGF(人上皮生長因子)和(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)并包含哺乳動物細(xì)胞生長必需的常鹽、氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，擴(kuò)增具有上皮樣形態(tài)的??胞群。

12.權(quán)利要求11的方法，其中所述成熟肝細(xì)胞在防凍劑存在下冷凍在含血清培養(yǎng)基中，然后在按照步驟(i)培養(yǎng)前融化。

13.權(quán)利要求12的方法，其中所述防凍劑是二甲亞砜。

14.權(quán)利要求11-13中任一項的方法，其中步驟(i)的細(xì)胞培養(yǎng)基是肝細(xì)胞培養(yǎng)基。

15.權(quán)利要求11-14中任一項的方法，其中步驟(ii)的含血清培養(yǎng)基是補(bǔ)加胎牛血清(FCS)或人血清(HS)、抗生素和谷氨酰胺的αMEM-EBM(3∶1體積/體積)的混合物。

16.權(quán)利要求11-15中任一項的方法，其中所述成熟肝細(xì)胞按照步驟(i)培養(yǎng)至少2周。

17.權(quán)利要求11-16中任一項的方法，其中所述分離的非卵圓人肝多能祖細(xì)胞系還進(jìn)行條件永生化。

18.權(quán)利要求11-17中任一項的方法，其中還通過在培養(yǎng)基中用半乳糖代替葡萄糖，使所述分離的非卵圓人肝多能祖細(xì)胞系進(jìn)行代謝選擇。

19.一種將權(quán)利要求1-10中任一項的非卵圓人肝多能祖細(xì)胞系分化為成熟肝細(xì)胞的方法，所述成熟肝細(xì)胞能夠表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞色素P450并能夠合成尿素，所述方法包括在補(bǔ)加肝細(xì)胞生長因子(HGF)和成纖維細(xì)胞生長因子4(FGF-4)的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞系。

20.權(quán)利要求19的方法，其中所述含血清培養(yǎng)基是補(bǔ)加10％FCS或HS、HGF和FGF-4的MEM-EBM。

21.一種將權(quán)利要求1-10中任一項的非卵圓人肝多能祖細(xì)胞系分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞的方法，所述方法包括在至少2g/l葡萄糖存在下在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞系。

22.權(quán)利要求21的方法，其中所述含血清培養(yǎng)基還包含煙酰胺。

23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述含血清培養(yǎng)基是補(bǔ)加2％FCS或HS、4.5g/l葡萄糖和10mM煙酰胺的DMEM。

24.一種將權(quán)利要求1-10中任一項的非卵圓人肝多能祖細(xì)胞系分化為成骨細(xì)胞的方法，所述方法包括在補(bǔ)加抗壞血酸-2-磷酸酯和地塞米松以及無機(jī)磷酸鹽的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞系。

25.權(quán)利要求24的方法，其中所述含血清培養(yǎng)基是補(bǔ)加10％FCS、10％HS、1nM地塞米松和0.5μM抗壞血酸-2-磷酸酯的αMEM。