[發明專利]蝶酸及其綴合物的合成和純化

有效

• 申請號: 200680016287.0
• 申請日: 2006-03-14
• 公開（公告）號: CN101175757A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 許樂村;I·R·弗拉霍夫;C·P·利蒙;H·K·桑塔普拉姆;李春紅
• 申請（專利權）人: 恩多塞特公司
• 主分類號: C07D475/08
• 分類號: C07D475/08;A61K31/00;A61K31/519
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 劉冬;范赤

相關申請的交叉參考

本申請依照35?U.S.C.§119(e)要求2005年3月16日提交的美國臨時申請系列號60/662,277的權益，該申請的公開內容結合到本發明中作為參考。

技術領域

本發明涉及蝶酸和蝶酸衍生物的純化，以及涉及與其它化合物綴合的蝶酸和蝶酸的類似物和衍生物的純化。本發明還涉及制備與其它化合物綴合的蝶酸和蝶酸的類似物和衍生物的方法。本發明還涉及用與其它化合物綴合的蝶酸和蝶酸的類似物和衍生物治療患者的方法。

背景

蝶酸是制備葉酸酯衍生物的一種常規原料，可將其與藥物結合以用作治療上的綴合物(conjugates)，所述綴合物包括以維生素受體為基礎的靶標作用綴合物。維生素-藥物綴合物可被靶向作用于例如獨特表達、過度表達或優先表達維生素受體的癌細胞。例如，一直使用蝶酸作為制備一種綴合物的原料，所述綴合物包含一種通過γ羧基連接的亞乙基二胺橋連接于熒光素的葉酸衍生物。這種綴合物在美國專利申請序列號09/822,379中描述，該專利公開內容結合到本發明中作為參考。所述綴合物被用于以熒光素標記病原性細胞(如癌細胞)，使癌細胞為抗原性的，以使其能被宿主免疫系統識別和清除。

蝶酸可通過各種常規方法制備，所述方法包括合成、葉酸的微生物降解、葉酸的酶降解、葉酸的水解以及其它常規方法。一般來說，通過這些方法制備的蝶酸通?？杀幌喈斄康娜~酸污染。例如，經酶降解制備的蝶酸可含有25％的葉酸。因此，需要有效的方法除去葉酸污染物以及源于蝶酸制備的其它雜質。

可使用合成方法制備維生素-藥物綴合物，包括蝶酸的綴合物。在某些情況下，那些合成方法還可以導致副產物、雜質或其它污染物的形成。因此，需要合成和/或純化方法來避免形成這些副產物、雜質或其它污染物，或者除去這些副產物、雜質或源于維生素-藥物綴合物的其它污染物。

發明概述

本發明描述純化蝶酸、蝶酸衍生物及其組合的方法。在通過層析法純化蝶酸、蝶酸衍生物及其組合的一個示例性實施方案中，本發明所述的方法包括以下步驟：(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的溶液與離子交換層析載體(support)接觸；(b)用pH約為10或10以上的流動相洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的第一種流分(fraction)；(c)將第一種流分的pH降低至約3或3以下；以及(d)沉淀蝶酸、蝶酸衍生物或其組合。

在通過層析法純化蝶酸、蝶酸衍生物及其組合的另一示例性實施方案中，本發明所述的方法包括以下步驟：(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的溶液與陰離子交換層析載體接觸；和(b)洗脫包含蝶酸、蝶酸衍生物或其組合的第一種流分。

本發明所述的方法還可任選包括洗脫包含葉酸、葉酸衍生物或其組合的第二種流分的步驟(e)，其中第一種流分和第二種流分基本分離。實際的分離包括通過時間、通過預定的流分數目或者其它定量或定性的判定而確定的分離，其表明在第一和第二種流分洗脫期間，第一和第二種流分基本上不重疊。

本發明所述層析方法中的層析載體包括但不限于離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、糖基樹脂、糖基離子交換樹脂、糖基陰離子交換樹脂等。本發明所述層析方法中的流動相包括但不限于具有pH約為10或10以上、約11或11以上或者具有pH范圍為約11-13的水相。在一示例性變化方面，流動相不含或基本不含氨或其鹽。本發明所述層析方法中的流動相還可任選包括有機共溶劑，如丙酮、四氫呋喃、乙腈、醇類(包括MeOH、EtOH等)以及其它溶劑等。

在另一示例性實施方案中，描述純化包含蝶酸或其衍生物和熒光素或其衍生物的綴合物的方法。在一方面，那些方法包括以下步驟：(a)使包含所述綴合物的溶液與第一種反相層析載體接觸；(b)用流動相洗脫包含所述綴合物的磷酸鹽復合物(complex)的第一種流分，該流動相包含磷酸鹽，且pH范圍約為6-8；(c)使第一種流分與第二種反相層析載體接觸；以及(d)用含水的流動相洗脫包含所述綴合物的第二種流分，其中所述第二種流分基本上無磷酸鹽。

本發明所述層析方法中的層析載體包括但不限于反相樹脂，如C8樹脂、C18樹脂、其封端變體(capped?versions)等。本發明所述層析方法中的流動相包括但不限于水相，其具有的pH為近中性或者稍微中性以上，包括pH范圍約7.1-7.7，如pH約為7.4。在一示例性的變化方面，流動相包括一或多種磷酸鹽。在另一示例性的變化方面，流動相不含或基本不含磷酸鹽。本發明所述層析方法中的流動相還可任選包括有機共溶劑，如MeOH、EtOH、丙酮、四氫呋喃、乙腈等。