[發明專利]原種事件A5547－127以及在生物樣品中鑒定此類事件的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 200680011600.1
• 申請日: 2006-04-04
• 公開（公告）號: CN101155933A
• 公開（公告）日: 2008-04-02
• 發明（設計）人: M·德博克勒爾
• 申請（專利權）人: 拜爾生物科學公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;林柏楠

發明領域

本發明涉及鑒定在生物樣品中存在包含特定轉化事件A5547-127的植物材料，以及包含此類事件的轉基因大豆植物、植物材料和種子的方法和試劑盒。本發明的大豆植物將除草劑耐受表型與農藝學特征、遺傳穩定性和對不同遺傳背景的適應性結合在一起，等同于缺乏雜草壓力的非轉化大豆品系。

發明背景

在植物中轉基因的表型表達依據基因自身結構和其在植物基因組中的位置而決定。同時，轉基因(外源DNA)存在于基因組的不同位置將以不同方式影響植物的整體表型。在農藝學或工業上，通過基因操作向植物中成功引入商業上感興趣的性狀是一個依賴于不同因素的漫長過程。遺傳轉化的植物實際上的轉化和再生僅僅是一系列選擇步驟的第一步，這一系列步驟包括廣泛的遺傳特征鑒定、育種和田間試驗的評估，最終導致原種事件的選擇。

考慮到在新食品/飼料、GMO和非GMO產品的分離以及獨有材料的鑒定方面的討論，對于原種事件的明確鑒定變得日益重要。理想的此類鑒定方法是既迅速又簡單、不需要很多的實驗室裝置。此外，該方法應該提供在沒有專家解釋的情況下允許明確鑒定原種事件的結果，但是如果需要可以展示給專家詳察。

通過用包含編碼耐受膦絲菌素的合成pat基因的質粒轉化大豆，選擇A5547-127作為在大豆(Glycine?max?L.)發育中對抗除草劑Liberty的原種事件，并且可以作為Liberty?Link大豆商業銷售。這里描述在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的簡單和明確的方法中使用的手段。

發明概述

本發明涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的方法，其基于特異性識別A5547-127的5’和/或3’側翼序列的引物或探針。

更具體地，本發明涉及方法，其包含擴增生物樣品中存在的核酸序列，即使用至少兩種引物進行聚合酶鏈式反應，其中一種引物識別A5547-127的5’或3’側翼區，另外一種引物識別外源DNA中的序列，優選獲得的DNA片段在100和500bp之間。引物可以分別識別A5547-127的5’側翼區內的序列(SEQ?ID?No.1，從1-311位點)或3’側翼區內的序列(SEQ?ID?No.2從510-1880位點的互補序列)和外源DNA內的序列(SEQ?ID?No?1從312-810位點的互補序列或SEQ?ID?No?2從1-510位點)。此處所描述的識別5’側翼區的引物可能包含SEQ?ID?No.15的核苷酸序列，且識別外源DNA內序列的引物可能包含SEQ?ID?No.13的核苷酸序列。

本發明更具體涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的方法，其包含擴增生物樣品中存在的核酸序列，即使用分別含有SEQ?ID?No.15和SEQ?ID?No.13的核苷酸序列的兩種引物進行聚合酶鏈式反應，獲得的DNA片段約為151bp。

本發明還涉及此處描述的A5547-127的特異側翼序列，可以用其發展在生物樣品中特異鑒別A5547-127的方法。更具體地，本發明涉及A5547-127的5’和/或3’側翼區，可以用其發展此處進一步描述的特異引物和探針。本發明還涉及生物樣品中存在A5547-127的鑒定方法，其基于使用此類特異引物或探針。引物可以由17到約200個連續的核苷酸序列(選自SEQ?ID?No?1從1-311核苷酸序列、或SEQ?ID?2從510-1880核苷酸的互補核苷酸序列)組成，與由17到約200個連續的核苷酸序列的引物(選自SEQ?ID?No?1從312-810核苷酸、或SEQ?ID?No?2從1-510核苷酸的互補序列)組合使用。引物也可以在它們的3’末端包含這些核苷酸序列，并且引物還包含非相關序列或從所述核苷酸序列衍生而來、但是含有錯配的序列。

本發明還涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種引物或探針，其特異性識別A5547-127的5’或3’側翼區。

本發明的試劑盒除包含特異性識別A5547-127的5’或3’側翼區的引物以外，可能還包含第二種引物用于PCR鑒定方法，所述第二種引物特異性識別A5547-127的外源DNA內的序列。優選地，本發明的試劑盒包含兩種特異引物，其中一種識別A5547-127的5’側翼區內的序列，而其中另一種識別外源DNA內的序列。特別是識別5’側翼區的引物可能包含SEQID?No.14的核苷酸序列，并且識別轉基因的引物可能包含SEQ?ID?No.13的核苷酸序列或任何此處所描述的其它引物。