[發明專利]用于進行涉及核酸分子的直接酶反應的方法

無效

• 申請號: 200680006345.1
• 申請日: 2006-02-08
• 公開（公告）號: CN101128604A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 梁寧根;金鐘烈;金圣旭;李承寬
• 申請（專利權）人: 生物探索公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京金信立方知識產權代理有限公司
• 代理人: 朱梅;徐志明

技術領域

本發明涉及一種直接使用生物樣品進行涉及核酸分子的直接酶反應的方法及其試劑盒。

背景技術

自從Watson和Crick闡明DNA的雙螺旋結構以來，核酸分子已變成分子生物學中最重要的對象和目標。另外，已廣泛開發和研究了使用核酸分子作為底物或模板的酶，且已經提出了包括克隆和誘變的多種操作核酸分子的技術。

Mullis等人(1～3)已在二十世紀八十年代末開發了聚合酶鏈式反應(PCR)，其在分子生物學中邁出了巨大一步。此外，已報道了如連接酶鏈反應(LCR)、分枝DNA技術(bDNA)、轉錄介導的擴增(TMA)、雜交保護分析(HPA)、雜交捕獲系統、鏈置換擴增(SDA)、環狀探針技術(CPT)、實時PCR、侵染檢測和環介導等溫擴增(LAMP)的多種核酸操作技術，以滿足如基因工程、蛋白質工程、診斷學和治療學的研究和工業領域中的多種需要。

同樣地，核酸分子被廣泛地應用到多種領域中，它們的應用不可缺少地伴隨有預純化(分離)方法。換句話說，因為含有核酸分子的生物樣品很可能含有酶反應特別是酶的抑制劑，所以在應用之前需要將核酸分子與抑制劑分離。例如，因為生物樣品中存在的各種物質抑制PCR過程，從而不能得到所需結果，所以PCR方法通常使用從生物樣品中純化的核酸分子作為模板。

為了從生物樣品中分離或純化核酸分子，通常采用酚-氯仿抽提、離子交換層析或使用玻璃珠的方法。然而，這些被認為煩瑣的方法是耗時和耗成本的方法。此外，眾所周知酚對人類和環境是十分有毒的。因此，如果可以將生物樣品直接進行涉及核酸的酶反應，那么可以具有多種優點。

將血液樣品用擴增發應，尤其是PCR進行分析。然而，因為在血液樣品中存在多種聚合酶的酶抑制劑，所以血液樣品在直接進行擴增反應中具有固有局限性。其固有的抑制劑包括血紅蛋白(4)、免疫球蛋白G(IgG)(5)、鹽(例如，K⁺和Na⁺)、膽鹽以及血細胞中的脫氧核糖核酸酶和蛋白酶。另外，如EDTA、肝素和檸檬酸鈉的抗凝劑對擴增反應，特別是PCR呈現出強的抑制活性。

不經過核酸純化的直接擴增反應是可行的，可以克服與核酸純化相關的許多缺點，其包括(i)傳染研究者；(ii)核酸樣品間的交叉污染；(iii)核酸損失，尤其是在存在痕量樣品時；(iv)損耗時間和成本；以及(v)難以自動操作。與此相關，已進行許多研究以提出用于進行直接酶反應的方法。

例如，Mercier等人(6)，Panaccio等人(7)和McCusker等人(8)已報道了直接使用血液樣品的PCR法。另外，Panaccio等人(9)已經提出了使用血液樣品的直接PCR法。然而，所述方法的缺點在于血液樣品與甲酰胺混合并使混合物進行預反應(9，10)。Burckhardt公開了改變PCR反應中的陽離子濃度以使用高達80％(v/v)的血液樣品進行直接PCR(11)。根據Burckhardt的方法，PCR反應的配方和組成根據血液樣品的量而改變，且在擴增反應之前將血液樣品預熱。

雖然前述報道描述了使用血液樣品進行直接PCR的可能性，但是需要解決如需要單鏈DNA結合蛋白(T4基因32蛋白(gp32))(12)或特殊的預處理的不方便性(8，13)。

最近，包括Makowski等人(14)、Kreader(12)和Satoh等人(15)的一些研究者也已報道了直接PCR反應。

Al-Soud等人已研究將從細菌中分離的DNA樣品與不同量的如血液、糞便以及干酪和肉的懸浮液的生物樣品混合，然后使用各種熱穩定的DNA聚合酶和PCR促進劑進行PCR擴增。結果，他們發現牛血清白蛋白(BSA)、甜菜堿和gp32可以防止血液樣品抑制PCR反應。然而，他們的試驗使用與如血液的生物樣品人工混合的DNA樣品而不是生物樣品本身，其不能反映直接擴增反應的真實條件。而且，他們使用相對高含量的DNA樣品(1ng/25μl反應物)，從而他們不能評價是否能使用這種PCR促進劑進行痕量DNA樣品擴增。