[發(fā)明專利]與BCL－2蛋白質(zhì)家族抗細胞凋亡成員相互作用的新肽及其用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680003805.5
• 申請日: 2006-01-31
• 公開（公告）號: CN101111517A
• 公開（公告）日: 2008-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: O·熱內(nèi)斯特;J·希克曼;J－C·雷恩
• 申請（專利權(quán)）人: 瑟維爾實驗室;哈伯里健尼克斯公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/63;G01N33/68;G01N33/566;G01N33/58;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所
• 代理人: 黃革生;林柏楠

本發(fā)明屬于搜索和鑒定與Bcl-2蛋白質(zhì)家族抗細胞凋亡成員相互作用 的新肽的領(lǐng)域。

本發(fā)明涉及篩選和鑒定那些新肽與Bcl-2蛋白質(zhì)家族抗細胞凋亡成員 間蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)劑的方法。通過這種篩選方法分離的調(diào)節(jié)劑可用 于調(diào)節(jié)細胞凋亡型和/或自體吞噬型程序性細胞死亡。這些調(diào)節(jié)劑在治療癌 癥過程中給患者施用。

本發(fā)明涉及每一個都能與Bcl-2蛋白質(zhì)家族抗細胞凋亡成員相互作用 的五個肽基序并涉及其在癌癥患者中引起程序性細胞死亡的用途。

在一個方面，程序性細胞死亡包括細胞凋亡，在另一個方面包括自體 吞噬死亡。細胞凋亡是更熟知的現(xiàn)象。這種類型的細胞死亡包括形態(tài)學(xué)變 化，如核凝集和DNA片段化，也包括生化現(xiàn)象，如胱天蛋白酶的活化(其 然后降解細胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分從而引起細胞解裝配和死亡)。細胞凋亡過 程的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的并包括多個胞內(nèi)信號通路的激活或抑制。自體吞噬死亡 是第二位的不太熟知的程序性細胞死亡機制。在細胞水平上，自體吞噬可 概括為三個階段：起始自體吞噬泡(自噬體)的形成、自噬體成熟為降解 性泡然后其與溶酶體融合。因此自體吞噬死亡包括溶酶體降解過程，其特 征在于自體吞噬泡的累積并且不依賴胱天蛋白酶型調(diào)節(jié)通路。

保持細胞存活或使其程序性死亡使得尤其是BCl-2蛋白質(zhì)家族參與的 主要信號通路的調(diào)節(jié)成為必需。

BCL-2蛋白質(zhì)家族分為三個主要類別。抗細胞凋亡蛋白質(zhì)(如Bcl-2、 Bcl-X_L和Bcl-W)在其四個BH結(jié)構(gòu)域中具有高度的同源性。促細胞凋亡 蛋白質(zhì)分成兩類：一類是多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(如BAX和BAK)，另一類是 促細胞凋亡蛋白質(zhì)(如BID、NOXA、PUMA、BIK、BIM和BAD)，其 特征在于存在單一同源結(jié)構(gòu)域-BH3基序(Cory和Adams，The?Bcl-2 family：regulators?of?the?cellular?life-or-death?switch?Nature?reviews，第12 卷，2002年9月)。

BH3基序為兩親性α螺旋區(qū)域，其在Bcl-2蛋白質(zhì)家族中的序列同一 性相對較低。此外，蛋白質(zhì)中需要存在BH3基序以允許與Bcl-2蛋白質(zhì)家 族抗細胞凋亡成員相互作用。實際上，Bcl-2蛋白質(zhì)家族抗細胞凋亡成員的 活性受所述家族的促細胞凋亡基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)，兩種蛋白質(zhì)組裝成異二聚體。 當(dāng)處于那種狀態(tài)的時候，Bcl-2蛋白質(zhì)家族的抗細胞凋亡成員是無活性的并 且因此不再具有其抗細胞凋亡活性。此外，BH3基序與Bcl-2蛋白質(zhì)家族 抗細胞凋亡成員的特異相互作用可由調(diào)節(jié)劑修飾從而以特定方式引起程序 性細胞死亡。

因此本發(fā)明計劃篩選和鑒定與Bcl-2蛋白質(zhì)家族抗細胞凋亡成員相互 作用的新肽，從而用這些新肽篩選和鑒定能修飾那些相互作用的化合物以 獲得有效用于細胞凋亡下調(diào)所涉及病理(尤其是癌癥)真正候選藥劑。

最開始雙雜交系統(tǒng)由兩種重組蛋白質(zhì)在酵母中的檢測組成。第一種蛋 白質(zhì)(稱作“餌”)為含有與蛋白質(zhì)A上游結(jié)合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或 BD)的融合蛋白。第二種蛋白質(zhì)也是融合蛋白，通常稱作“獵物”，其含 有與蛋白質(zhì)B結(jié)合的激活結(jié)構(gòu)域(或AD)。通常使用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激 活結(jié)構(gòu)域為Gal4或大腸桿菌(E.Coli)Lex?A的結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)A和B 分別為Bcl-2蛋白質(zhì)家族抗細胞凋亡成員和從cDNA庫中獲得的基序。蛋 白質(zhì)A和B通過蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合允許通過互補形成能結(jié)合報告基因 上游存在的結(jié)合位點(或BS)并且確保該報告基因轉(zhuǎn)錄的功能性結(jié)構(gòu)域 (BD-AD)。

然而，這種常規(guī)的雙雜交系統(tǒng)具有其局限性。例如，眾所周知，此類 篩選方法可造成假陽性和/或假陰性并且需要通過生化驗證所獲得的結(jié)果。 雙雜交系統(tǒng)獲得的假陽性尤其頻繁并且證明的是功能相互作用而非結(jié)構(gòu)相 互作用。

國際專利申請WO?99/42612或?qū)＠鸘S?6,187,535中描述了允許假陽性 和/或假陰性最小化的更有效技術(shù)并且使用含“餌”和“獵物”多肽的重組 單倍體酵母。這個系統(tǒng)允許以比本領(lǐng)域所用的其它常規(guī)方法更精確、更高 重復(fù)性和更靈敏的方式用單個的“餌”檢測更大數(shù)量的“獵物”。