[發明專利]高純度載脂蛋白A－I的制備方法

有效

• 申請號: 200610147503.7
• 申請日: 2006-12-20
• 公開（公告）號: CN101205250A
• 公開（公告）日: 2008-06-25
• 發明（設計）人: 黃凱;何秋;許必雄;包驤飛;李軍輝;沈積慧;李春洲
• 申請（專利權）人: 上海萊士血液制品股份有限公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K14/775
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及蛋白質制備，尤其涉及載脂蛋白A-I的制備方法。

背景技術

載脂蛋白A-I(Apolipoprotein?A-I，apoA-I)是高密度脂蛋白(HighDensity?Lipoprotein，HDL)的主要載脂蛋白，為單一多肽鏈，由243個氨基酸殘基組成，分子量28.3kD。HDL主要功能是參與膽固醇逆向轉運(ReverseCholesterol?Transport，RCT)，將外周組織細胞中的膽固醇移出并轉運至肝臟轉化清除，因而具有對抗動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)發生及發展的重要作用，而apoA-I是HDL抗AS功能的主要承擔者。apoA-I還具有抗炎抗內毒素的功能，因此是脂類代謝研究重點之一。由于apoA-I具有肝臟靶向作用的特點，在靶向藥物研究中也有良好的應用前景。

目前，獲得apoA-I的常用制備方法有超速離心法、有機溶劑沉淀法和高效液相法等，雖然能得到高純度apoA-I，但具有一些很明顯的缺點：①制備量小，一般只能獲得毫克級的apoA-I蛋白，不適于工業生產；②蛋白得率低，經超離心、有機溶劑沉淀、柱層析等多步處理，在制備過程中損失了大部分apoA-I；③成本高，需要超速離心機等貴重儀器；④安全性差，乙醇、丙酮、三氯乙酸等有機溶劑不僅具有生理毒性，而且易燃易爆，不利與安全生產。

另一方面，血漿組份四是人血漿經Cohn低溫乙醇法處理后的剩余部分，常因不能利用而被丟棄，其主要蛋白成分是白蛋白和β脂蛋白。

因此，本領域迫切需要提供一種制備apoA-I的方法，該方法的蛋白得率高、能較好地保持蛋白活性，同時成本低、而且適合于大規模的工業生產。另外，該方法還能將被丟棄的組份四加以合理應用，使血漿資源得到更充分的利用。

發明內容

本發明旨在提供一種從人血漿中獲得apoA-I的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種獲得載脂蛋白A-I的方法，它包括步驟：

a.將經Cohn低溫乙醇法獲得的組份四和1-8M的尿素混合形成組份四預處理溶液；

b.步驟a得到的組份四預處理溶液流過陰離子交換層析柱后，用含1-8M尿素，電導值1-4ms/cm的緩沖液I洗滌層析柱，得到含初步純化的載脂蛋白A-I的洗脫液I；

c.洗脫液I流過陰離子交換層析柱，用電導值1-15ms/cm的緩沖液II洗脫雜質后用電導30-100ms/cm的緩沖液III洗脫下純化的載脂蛋白A-I。

在另一優選例中，步驟a中組份四和尿素的重量比為1∶30-300。

在另一優選例中，步驟a中組份四和尿素的重量混合比為1∶90-240。

在另一優選例中，步驟a中組份四和尿素的重量混合比為1∶150-210。

在另一優選例中，步驟a、b中所述的尿素濃度為3-8M。

在另一優選例中，步驟a、b中所述的尿素濃度為5-7M。

在另一優選例中，緩沖液I的電導值為2-4ms/cm；緩沖液II的電導值為7-15ms/cm；緩沖液III的電導值為70-95ms/cm。

在另一優選例中，緩沖液I的電導值為2.5-3.6ms/cm；緩沖液II的電導值為9-12ms/cm；緩沖液III的電導值為80-90ms/cm。

在另一優選例中，步驟b、c中的洗脫緩沖液I、II或III中含有NaCl、KCl、MgCl₂或CaCl₂。

在另一優選例中，步驟b、c中的洗脫緩沖液I、II或III中含有NaCl。

在另一優選例中，步驟c所述的緩沖液II或III中含有0-1M尿素。

在另一優選例中，所述的陰離子交換層析柱為弱酸性或弱堿性陰離子交換層析柱。

在另一優選例中，所述的陰離子交換層析柱為QAE或DEAE陰離子交換層析柱。

在另一優選例中，所述的陰離子交換層析柱為DEAE陰離子交換層析柱。

在另一優選例中，步驟a和b之間還包括步驟a’：將組份四預處理溶液離心除不溶性雜質，并用濾膜過濾。

在另一優選例中，離心速度為6000-10,000rpm，濾膜孔徑為0.2-0.6μm。

在另一優選例中，步驟b和c之間還包括步驟b’：用電導值4.5-70ms/cm的緩沖液IV洗脫除去大部分雜質。

在另一優選例中，步驟c后還包括步驟c’：超濾換液，添加穩定劑，然后灌裝、冷凍干燥得成品。

在另一優選例中，緩沖液IV或V中含0-1M尿素。