[發明專利]人胃癌細胞NGAL基因啟動子區TPA核心反應元件

無效

• 申請號: 200610122992.0
• 申請日: 2006-10-24
• 公開（公告）號: CN101372690A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發明（設計）人: 李恩民;袁華敏;許麗艷;常靜霞;王子良
• 申請（專利權）人: 汕頭大學醫學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N15/85
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及基因表達調控，具體地說，涉及一種人胃癌細胞的NGAL基因啟動子區TPA核心反應元件。

背景技術

胃癌的發病率位于各類惡性腫瘤的前茅，死亡率也位于惡性腫瘤之首，總體來說有色人種比白色人種發病率高，日本、智利、俄羅斯和冰島為高發區，中國也是比較高發的國家；中國的發病率北方比南方高，沿海比內地高，以西北的甘肅，青海，寧夏等省自治區最高。目前，胃癌的發病機制尚不清楚。研究發現NGAL基因在很多腫瘤細胞包括胃癌細胞中發現有高表達；而12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)，這種促癌物在細胞惡性轉化過程中發揮非常重要的作用。有人曾研究報道永生化食管上皮細胞系SHEE經TPA誘導后可惡性轉化為食管癌細胞系SHEEC。最近我們研究發現在TPA的刺激下，BGC823胃癌細胞中NGAL基因啟動子區能激活熒光素酶報告基因，且其活性上升約為基礎表達時的3～9倍，表明NGAL基因啟動子區存在著TPA反應元件。

NGAL(neutrophil?gelatinase—associated?lipocalin)，即中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，是1993年K?jeldsen等在研究人中性粒細胞的明膠酶(gelatinase?B，即MMP-9)時首先被發現的。NGAL基因是單拷貝，定位于染色體9q34上。NGAL基因的全長5869bp，其中包括1695bp的5’端非轉錄區，178bp的3’端非轉錄區及由七個外顯子和六個內含子構成的3696bp的原初轉錄區(primary?transcribedregion)。其cDNA全序列由63bp的5’端非翻譯區和591bp的編碼區組成，編碼含197個氨基酸殘基的肽鏈，此肽鏈包括178個氨基酸殘基的成熟肽段(mature?peptide)和19個氨基酸的前導序列(leadersequence)。

越來越多的證據表明NGAL與炎癥、免疫反應、細胞分化、細胞凋亡、組織重構以及多種腫瘤的發生與發展等過程相關，并在很多腫瘤中如食管癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌等高表達。也有研究報道NGAL與腎缺血，腎毒性損傷以及動脈粥樣硬化等相關。目前的研究主要集中在NGAL蛋白的功能、細胞中與NGAL蛋白相互作用的分子及其作用機制，而關于NGAL高表達的原因以及該基因的轉錄表達調控機制的研究，報道尚不多見。Cowland曾報道在A549肺癌細胞系中IL-1β能上調NGAL的表達，并在NGAL?5’側翼區鑒定出了IL-1β核心反應元件。為了弄清胃癌細胞中TPA上調NGAL表達的機制，我們在BGC823胃癌細胞系中獲得了NGAL基因啟動子區TPA核心反應元件，由此完成了本發明。在本文所述的TPA核心反應元件稱之為hNTRE。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人胃癌細胞NGAL基因啟動子區TPA核心作用元件，確定人NGAL基因5’上游轉錄調控區域的TPA核心作用區間。

本發明的另一個目的在于提供含有上述基因TPA核心反應元件的載體。

本發明的進一步目的在于提供含有上述載體的宿主細胞。

本發明提供的人胃癌細胞NGAL基因啟動子區TPA核心反應元件，命名為hNTRE。其長度為31bp，核苷酸序列如SEQIDNo：1所示，位于NGAL基因5’上游-109～-79的片段，其中NGAL基因的啟動子所包含的TATA?Box在該元件下游，在-37的位置。

正如在下述實施所詳細描述的，為了獲得本發明的TPA核心反應元件hNTRE，對人NGAL基因的啟動子區進行不同方法的缺失，插入到pGL3-Basic載體，得到一系列序列長度不同的表達質粒，利用螢火蟲熒光素酶報告基因，檢測這些質粒在胃癌細胞BGC823中的轉錄活性。為減少細胞培養微環境所造成的誤差，以表達海腎熒光素酶的質粒pRL-TK作為內參照，與上述缺失質粒同時轉染BGC823細胞，測定螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的酶活性，用二者的比值，即相對熒光素酶活性表示基礎轉錄活性。在轉染24小時后，再加入TPA刺激24小時，檢測出各個載體的相對熒光素酶活性，再算出與各自基礎活性比較的上升倍數，經過多次重復實驗結果確定了-109～-79這段區間為TPA核心反應元件。