[發明專利]一種重組人胰島素的制備方法

有效

• 申請號: 200610117742.8
• 申請日: 2006-10-30
• 公開（公告）號: CN101173006A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 王偉剛;曹韞旭;文良柱
• 申請（專利權）人: 江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及蛋白質多肽類藥物領域，尤其涉及一種重組人胰島素的制備方法。

背景技術

糖尿病是僅次于心血管和腫瘤的第三大致死疾病，現今世界上已有2億糖尿病患者，而且每年新增約600萬新病例，每年死于糖尿病及相關并發癥者達到320萬(2006年6月美國糖尿病年會報告)。胰島素是治療糖尿病的特效藥，尤其是在治療I型糖尿病和II型糖尿病晚期患者時，還沒有其它藥物可以代替。胰島素在臨床上已經成功地應用了80多年。隨著生物技術的發展，重組人胰島素已經逐漸取代了動物內臟提取的動物胰島素。隨著對糖尿病患者人群的擴大和胰島素用藥方式的多樣化(口服給藥、肺部給藥和口腔噴霧給藥等)，胰島素的用量迅速增加，因此，提高胰島素的產量，降低胰島素的生產成本，滿足廣大糖尿病患者用藥的需求，不僅具有重要的經濟意義，而且具有重要的社會意義。

目前應用大腸桿菌表達重組人胰島素生產方式主要要包括三種方式：一種是美國Eli?Lilly?and?Company(禮來公司)1982年采用的重組大腸桿菌分別表達胰島素的A鏈和B鏈，表達產物經氰化溴(bromine?cyanide，CNBr，中文別名：溴化氰)切下多余片段后，得到的A鏈和B鏈經純化后再進行復性，最后得到有活性的重組人胰島素。由于A鏈和B鏈共存在6個半胱氨酸，復性率只有10％左右，所以采用這條工藝路線生產胰島素的成本高，每克成本在100美元以上。第二種也是美國Eli?Lilly?and?Company建立的，目前仍然采用此工藝生產年產量達十幾噸的重組人胰島素。將含有A鏈、B鏈和C肽的胰島素原在大腸桿菌中表達，在這種人胰島素原表達工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構象，三對二硫鍵的正確配對率也相應提高，折疊率高達80％以上。雖然這條工藝路線并不比A、B鏈分別表達法更為簡捷，在去除肽鏈過程中使用了CNBr，而且還要使用胰蛋白酶和羧肽酶B兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產品的成本僅50美元。第三種方式是采用丹麥NovoNordisk公司(諾和諾德公司)所采用的A、B鏈同時表達的方法，在A鏈前端和A、B鏈中間均有甲硫氨酸，表達后純化的產物經CNBr處理，得到A鏈和B鏈，再經過復性和純化得到有活性的重組人胰島素，這種方式與第一種方式同樣存在復性率低和生產成本高的問題。

現有重組人胰島素的生產方法中存在在生產過程中使用劇毒CNBr之技術缺陷。通過吸入、食入、經皮吸收，對人體健康造成極大危害，例如吸入后引起頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、虛弱、驚厥、昏迷、咳嗽、呼吸困難，重者發生肺水腫，可致死；對眼和皮膚有強烈刺激性。其危險特性在于：與水或水蒸氣接觸會放出劇毒、易燃和腐蝕性的溴化氫和氰化氫氣體。有不純物質存在時能很快引起分解，并引起爆炸。因而操作條件苛刻，對環境保護措施要求高。另外簡化重組人胰島素的生產工藝、提高收率和降低生產成本不但可以滿足臨床對胰島素用藥量的需求，也可以滿足越來越多中低收入患者和發展中國家糖尿病患者的對重組人胰島素價格的要求。

發明內容

發明人經過廣泛而深入的研究，對大腸桿菌表達重組人胰島素的制造方法進行了改進，經過廣泛試驗改進了胰島素原包涵體的溶解、包涵體純化和胰島素原的酶切轉化條件。最終實現了避免使用CNBr，簡化重組人胰島素的生產工藝并提高了重組人胰島素的收率。

因而，本發明所要解決的技術問題是提供一種大腸桿菌表達重組人胰島素的制備方法以克服現有技術中存在的使用有毒有害物質CNBr、生產工藝復雜之技術缺陷。

本發明的一種重組人胰島素的制備方法，包括如下步驟：

(a)表達重組人胰島素原的大腸桿菌菌體破碎，收集包涵體；

(b)洗滌包涵體，然后溶解包涵體使人胰島素原磺化；

(c)用陽離子交換法純化步驟(b)的人胰島素原；

(d)純化的人胰島素原復性，用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切轉化；

(e)用陰離子交換法純化步驟(d)的酶切產物；和

(f)用本領域常用的方法結晶人胰島素，

其特征在于，步驟(b)所述的人胰島素原磺化是通過將人胰島素原中的胱氨酸殘基的巰基(-SH)取代為-SSO₃^-實現的。