[發(fā)明專利]一種重組人胰島素的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610117742.8
• 申請(qǐng)日: 2006-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN101173006A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王偉剛;曹韞旭;文良柱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/62
• 分類號(hào): C07K14/62;C07K1/14
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種重組人胰島素的制備方法，包括如下步驟：

(a)表達(dá)重組人胰島素原的大腸桿菌菌體破碎，收集包涵體；

(b)洗滌包涵體，然后溶解包涵體使人胰島素原磺化；

(c)用陽(yáng)離子交換法純化步驟(b)的人胰島素原；

(d)純化的人胰島素原復(fù)性，用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切轉(zhuǎn)化；

(e)用陰離子交換法純化步驟(d)的酶切產(chǎn)物；和

(f)用本領(lǐng)域常用的方法結(jié)晶人胰島素，

其特征在于，步驟(b)所述的人胰島素原磺化是通過(guò)將人胰島素原中的胱氨酸殘基的巰基(-SH)取代為-SSO₃^-實(shí)現(xiàn)的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，溶解包涵體的條件是：終濃度為50mM的EDTA、終濃度50mM的Tris-HCl、終濃度為6M的尿素、終濃度為0.2M的亞硫酸鈉、終濃度為0.1M的連四硫酸鈉、pH?9.0-10.5。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，經(jīng)陽(yáng)離子交換法純化的人胰島素原S-磺酸鹽復(fù)性的條件是：蛋白濃度0.5～1.0mg/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，人胰島素原復(fù)性的條件是：緩沖液為含1M尿素的50mM的Gly緩沖液(pH11.5)，通氮?dú)猓瑤€基乙醇的濃度與胰島素原的摩爾比為1∶3～6。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，步驟(c)的陽(yáng)離子交換介質(zhì)采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換介質(zhì)SP?Sepharose?FF，步驟(e)的陰離子交換介質(zhì)采用TEME介質(zhì)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，步驟(c)的層析條件是：將步驟(b)溶解的包含體溶液用6M尿素稀釋，4℃條件下離心，上清上SP?Sepharose?FF柱進(jìn)行層析，用1M?NaCl洗柱，再用含3M乙酸鈉、1M?NaCl的洗脫液平衡，收集洗脫峰。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任一所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于，所述的人胰島素原有高等電點(diǎn)。