[發(fā)明專利]5＇核苷酸酶診斷試劑盒及5＇核苷酸酶活性濃度測(cè)定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610097254.5
• 申請(qǐng)日: 2006-10-26
• 公開（公告）號(hào): CN101169376A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王爾中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78;G01N21/25;C12Q1/32;C12Q1/26;C12Q1/00
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種5′核苷酸酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定5′核苷酸酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

醫(yī)學(xué)研究表明，5′-核苷酸酶(5′NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時(shí)，5′NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時(shí)5′NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?′-核苷酸酶活性無生理性升高，對(duì)于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測(cè)定5′-核苷酸酶的活性對(duì)于疾病的診斷具有重要意義。

5′-核苷酸酶的活性測(cè)定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng)酸測(cè)磷法(1925年)。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用同位素底物測(cè)試法，方法為：5′-核苷酸酶作用于H³-dUMP，終止反應(yīng)后，通過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無機(jī)磷含量得以計(jì)算出5′-核苷酸酶的活性。

同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測(cè)定儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無機(jī)磷測(cè)定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好，強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)通過酶聯(lián)反應(yīng)生成吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneimine?dye)，所導(dǎo)致在400-700nm波長(zhǎng)處吸光度的上升，得以測(cè)定5′核苷酸酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的5′核苷酸酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行5′核苷酸酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明5′核苷酸酶酶活性濃度測(cè)定方法原理如下：

腺苷單磷酸+水????5′核苷酸酶????腺苷+磷酸根

腺苷+水????腺苷脫氨酶????肌苷+氨離子

氨離子+丙酮酸+還原型輔酶????丙氨酸脫氫酶????L-丙氨酸????????????????????????????????????????????+水+輔酶

丙氨酸+水+氧????甘氨酸氧化酶????氨離子+丙酮酸+???????????????????????????????????????????????過氧化氫

過氧化氫+還原型色原體組合????過氧化物酶????吲嗒胺色原或?????????????????????????????????????????????????醌亞胺色原+水

5′核苷酸酶(5’nucleotidase；EC?3.1.3.5)、腺苷脫氨酶(adenosinedeaminase；EC?3.5.4.4)及丙氨酸脫氫酶(alanine?dehydrogenase；EC?1.4.1.1)作為作用酶，功能為將腺苷單磷酸經(jīng)三步酶解產(chǎn)生丙氨酸。甘氨酸氧化酶(glycine?oxidase；EC?1.4.3.19)作為循環(huán)酶：甘氨酸氧化酶的酶促作用將丙氨酸再次變回氨離子及丙酮酸，使氨離子及丙酮酸不斷地被重復(fù)循環(huán)利用，并不斷地循環(huán)產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase；EC?1.11.1.7)作為顯色酶，最終通過和過氧化氫的作用將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長(zhǎng)處，測(cè)定染料，吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneiminedye)，含量高低的光吸收大小，通過測(cè)量400-700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的速度，可以測(cè)算5′核苷酸酶的活性濃度大小。

實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5′核苷酸酶診斷試劑盒較為理想：

緩沖液??????????????100mmol/L

穩(wěn)定劑??????????????50mmol/L