[發(fā)明專利]一種用于研究精子發(fā)生的動(dòng)物模型

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610083839.1
• 申請(qǐng)日: 2006-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN101086809A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 狄茜;王琳芳;繆時(shí)英;宗書東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): G09B23/36
• 分類號(hào): G09B23/36
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明為一種以小鼠睪丸顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的研究精子發(fā)生的新的動(dòng)物模型，涉及該動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

精子發(fā)生是由精原細(xì)胞增殖分化形成精子的過(guò)程。在此過(guò)程中，精原干細(xì)胞通過(guò)有絲分裂使其數(shù)量得到擴(kuò)增，經(jīng)減數(shù)分裂，隨后再經(jīng)歷單倍體精子細(xì)胞的變形，發(fā)育為成熟精子。就其本質(zhì)而言，精子發(fā)生是在生精調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下，特異基因在特定的時(shí)空秩序上，精密有序的表達(dá)和相互作用的結(jié)果。對(duì)這些基因的深入研究對(duì)于闡明精子發(fā)生的分子機(jī)制，以及對(duì)人類的生殖健康、避孕疫苗的研制及男性不育的防治都有著十分重要的意義。

多年以來(lái)，在體外培養(yǎng)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物精子發(fā)生并產(chǎn)生形態(tài)功能正常的成熟精子細(xì)胞是很多人的研究目標(biāo)，但是由于精子發(fā)生的高度復(fù)雜性和對(duì)體內(nèi)微環(huán)境的依賴性，所以迄今為止尚無(wú)滿意的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠在體外完成精子發(fā)生。采用永生化的方法得到了一系列的生精細(xì)胞系，解決了原代生精細(xì)胞體外培養(yǎng)困難的問(wèn)題，但是這些永生化的生精細(xì)胞系在體外培養(yǎng)環(huán)境中往往還是停留在精母細(xì)胞階段，不能完成精子發(fā)生的全過(guò)程。基因敲除技術(shù)是研究精子發(fā)生相關(guān)基因的功能的最常用的方法之一，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大量基因的研究，而且，如果目的基因定位于Y染色體上，或者目的基因單倍劑量不足，或?qū)е戮硬荒馨l(fā)生或功能不正常，均會(huì)導(dǎo)致雄性不育，也就無(wú)法以常規(guī)方法獲得基因敲除小鼠。因此，探索研究精子發(fā)生的新研究方法是急待解決的課題。

1994年，Brinster等首次通過(guò)曲細(xì)精管顯微注射的方法將供體小鼠的精原干細(xì)胞移植進(jìn)入不育的受體小鼠的睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，使受體小鼠恢復(fù)生精并產(chǎn)生供體基因型的成熟精子，這標(biāo)志了精原干細(xì)胞移植技術(shù)的建立。供體精原干細(xì)胞在注射入受體小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)之后，能夠被受體小鼠的Sertoli細(xì)胞識(shí)別接納，進(jìn)入sertoli細(xì)胞所形成的巢(niche)中，在受體小鼠曲細(xì)精管內(nèi)增殖、分化，生成供體基因型的生精克隆。此后，精原干細(xì)胞移植研究日益成為闡明精子發(fā)生機(jī)制的有力工具。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是指由雙鏈RNA(double?stranded?RNA，dsRNA)介導(dǎo)的同源mRNA特異降解，從而導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post?transcriptional?gene?silencing，PTGS)的現(xiàn)象。RNA干擾自其發(fā)現(xiàn)之日起就成為基因功能研究的一個(gè)重要工具，目前它已經(jīng)廣泛地用于線蟲、果蠅、小鼠、人以及植物的基因功能的研究，成為功能基因組學(xué)的重要手段之一。siRNA應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能研究后，由于它不能完全抑制目的基因的表達(dá)，大多數(shù)情況下只是導(dǎo)致目的基因表達(dá)量的顯著降低，因此這種方法也稱為knock?down。雖然如此，siRNA產(chǎn)生的表型足以滿足基因功能的研究，因此在短短幾年時(shí)間內(nèi)，這種方法就成為基因功能研究的常規(guī)方法之一。但是迄今為止，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在體研究精子發(fā)生相關(guān)基因功能尚無(wú)成熟的技術(shù)和方法。

發(fā)明目的：

為了探索研究精子發(fā)生的新研究方法，本發(fā)明結(jié)合精原干細(xì)胞移植技術(shù)、RNA干擾技術(shù)和抗體注射技術(shù)，建立并完善了以小鼠睪丸顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ)的研究精子發(fā)生的新的動(dòng)物模型，對(duì)闡明精子發(fā)生過(guò)程中的重要基因和蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

內(nèi)容與要求：

本發(fā)明首先成功地建立和完善了小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)平臺(tái)。在該技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上成功建立了原代精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞株移植技術(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步應(yīng)用此平臺(tái)建立了體內(nèi)RNA干擾實(shí)驗(yàn)方法，在本發(fā)明建立的動(dòng)物模型中，原代供體生精細(xì)胞經(jīng)體外轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒敲減某基因?qū)⑵湟浦踩胄∈笄?xì)精管可連續(xù)進(jìn)行在體觀察。應(yīng)用該動(dòng)物模型在體驗(yàn)證了在精子發(fā)生過(guò)程中HSD-11基因可能和精原細(xì)胞自我更新和分化有關(guān)系。本發(fā)明建立了小鼠曲細(xì)精管顯微注射特異性抗體研究其相關(guān)基因?qū)影l(fā)生的影響的方法，通過(guò)該動(dòng)物模型，進(jìn)一步確證了rtSH3p13和RSD-9基因與精子頂體形成有密切關(guān)系。本發(fā)明建立的上述動(dòng)物模型為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)研究基因功能的新方法奠定了牢固的基礎(chǔ)。

該動(dòng)物模型達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為：

1、本發(fā)明成功地建立和完善了以通過(guò)睪網(wǎng)穿刺注射為主要注射方法的小鼠睪丸曲細(xì)精管顯微注射技術(shù)平臺(tái)(圖1)。

2、本發(fā)明成功建立了原代精原干細(xì)胞移植技術(shù)(圖2、3、4)。

3、本發(fā)明成功建立了精原細(xì)胞系GC-1spg細(xì)胞的移植技術(shù)(圖5、6)。