[發明專利]檢測人類免疫缺陷病毒的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 200610037593.4
• 申請日: 2006-09-11
• 公開（公告）號: CN101144771A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發明（設計）人: 程鋼;周新宇;何蘊韶
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: G01N21/00
• 分類號: G01N21/00;G01N33/48;C12Q1/68
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所屬領域

本發明涉及檢測臨床樣品中艾滋病病原體人類免疫缺陷病毒(Human?ImmunodificidncyVirus，HIV)HIV?I型(HIV-1)的方法及試劑盒，特別是涉及以實時定量熒光聚合酶鏈反應技術早期診斷HIV-l感染的方法及所使用的試劑盒。

發明背景

艾滋病的全稱叫獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired?Immunodeficiency?Syndrome，AIDS)，是一種由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的傳染病。HIV主要型別為HIV-l和HIV-2，艾滋病大多由HIV-1引起。HIV感染人體后特異性地侵犯并損耗T淋巴細胞造成肌體細胞免疫損傷。HIV感染的初期，感染者可以是無癥狀的病毒攜帶狀態。但感染發展到一定程度，感染者的免疫系統受到相當程度的損害時，病人將出現持續性全身淋巴結腫大綜合征(PGL)和艾滋病相關綜合征(ARC)，最后并發各種嚴重機會性感染和惡性腫瘤，成為艾滋病。目前無特效治療，病死率極高。

自1981年在美國洛杉磯首次發現艾滋病病例后，艾滋病正在全世界迅速流行。據世界衛生組織2004年12月報告提供的數據，全世界感染艾滋病病毒者達3940萬，其中僅2004年死于艾滋病的人數就達到310萬。現在艾滋病流行正以每天8500個新感染者的速度發展。尤其是占亞洲人口近50％的中國、印尼和越南的艾滋病病毒感染人數急劇增長。

在中國，自從1985年6月發現第一例艾滋病患者以來，艾滋病病毒己蔓延到所有31個省、自治區和直轄市。到2004年12月底，中國累積報告HIV感染人數89067人，AIDS病例數20786例，死亡5024人。據中國CDC及WHO預測，HIV/AIDS實際感染人數約84萬人。1999年，分子流行病學調查證實我國已有HIV-2型病毒存在，并首次從基因水平上確認我國存在HIV-1和HIV-2的混合感染，但目前我國存在的主要是HIV-1型感染，HIV-2型感染目前只有個別病例報道。

HIV感染的病毒學診斷技術一般包括病毒分離和病毒成份(如抗原、核酸)的檢測。實驗室檢查包括病毒分離培養、病毒核酸檢測、病毒蛋白抗原檢測、HIV抗體檢測等方法。

從早期的病毒分離培養，到FDA批準了第一個HIV抗體篩選試劑并用應用于獻血員篩選形成第一代的抗體檢測試劑以來(1985年3月1日)，迄今已經發展到第四代HIV抗體/抗原試劑，窗口期從最初3個月縮短到大約兩周。提高檢測的敏感性，縮短窗口期是HIV抗體檢測試劑持續發展的方向。

利用PCR檢測病毒RNA具有早期發現、靈敏度和特異性高等優點。RT-PCR方法雖然靈敏并能在早期對病毒進行檢測，但是因其步驟繁瑣且容易造成污染，從而使其使用上受到一定限制。

實時熒光定量PCR技術是上世紀90年代中期基于傳統的PCR技術發展起來的。與傳統的(終點檢測)PCR技術相比，實時定量監測方法不僅實現了低拷貝數靶多核苷酸的定量分析，而且還具有特異性和精確度更強、自動化程度更高以及污染的可能性更小等優點。

實時熒光PCR技術是在聚合酶鏈反應(PCR)體系中加入熒光標記探針，使用一種帶有核電偶聯裝置(CCD)的PCR擴增儀。通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光。收集檢測熒光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴增曲線。通過對擴增曲線以及循環閾值(Ct)的分析，即可以對檢測樣品進行定性和定量分析。實時熒光PCR將DNA擴增與檢測過程融合為一體動態檢測DNA擴增的全過程，省掉了PCR后處理過程大大縮短了結果分析時間，使得該方法更加快捷、方便。由于實時熒光PCR采取一種封閉的檢測模式，從而減少了氣溶膠污染和由此的造成的假陽性。因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。