[發(fā)明專利]重組人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體高密度發(fā)酵方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610030880.2
• 申請(qǐng)日: 2006-09-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101139623A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃陽(yáng)濱;孫九如;張翊;任軍;劉勇;劉華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海新生源生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C12N15/63;C12N15/70;C12N15/12;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明提供了一種高密度、高效的重組人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體表達(dá)工藝。

背景技術(shù)

卵巢癌發(fā)生率占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，死亡率居首位，5年生存率僅20％-40％。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，具有全身治療潛能的免疫治療已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。抗獨(dú)特型單鏈抗體由免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)組成，分子量小，是抗獨(dú)特型抗體的最小活性單位，組織穿透力強(qiáng)，體內(nèi)滯留時(shí)間短、清除快、能到達(dá)腫瘤的有效部位。但是異源蛋白會(huì)引起人抗鼠抗體反應(yīng)，對(duì)鼠源的抗獨(dú)特型抗體的基因進(jìn)行各種改造，可減少疫苗中的鼠源成分，并增加分子量，保留其免疫原性。

本發(fā)明人工合成人IgG1的鉸鏈區(qū)(hinge)和恒定CH3區(qū)融合基因(hC)，經(jīng)體外重組技術(shù)，與克隆的人卵巢癌抗獨(dú)特型抗體6B11的輕鏈及重鏈的可變區(qū)基因連接在一起，構(gòu)成完整的人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體融合基因6B11V_LV_HhC，實(shí)現(xiàn)了人源化的改造，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有特異性雙價(jià)結(jié)合卵巢癌單克隆抗體COC166-9和識(shí)別人免疫球蛋白IgGl的活性，為人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

以陽(yáng)性克隆建立原始種子庫(kù)，該種子庫(kù)的檢測(cè)表明無(wú)外源因子污染，各項(xiàng)生化指標(biāo)達(dá)到要求，表達(dá)水平達(dá)到要求。本發(fā)明提供了一種重組人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體的新型發(fā)酵方法，采用大腸桿菌表達(dá)體系以包涵體表達(dá)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝，整個(gè)過(guò)程穩(wěn)定、快速、簡(jiǎn)便，獲得高密度、高表達(dá)水平的重組人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供一種高密度的重組人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體的表達(dá)方案。包括用于該方案的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種工程菌，其特征在于，它含有編碼人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌是大腸桿菌。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種重組人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體的中試生產(chǎn)方法，該方法包括步驟：

a)在適合的表達(dá)條件下，在搖瓶中培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，從而以包含體形式表達(dá)出重組人卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體；

b)在適合的表達(dá)條件下，在5L發(fā)酵罐中線性放大發(fā)酵工藝。

c)在5L發(fā)酵罐中優(yōu)化出最佳中試生產(chǎn)方案。

附圖說(shuō)明

圖1中試不同培養(yǎng)基下目的蛋白表達(dá)電泳圖。1：Marker；?2：誘導(dǎo)前；3：改良M9-4誘導(dǎo)3小時(shí)；4：改良M9-4誘導(dǎo)2小時(shí)；5：改良M9-3誘導(dǎo)3小時(shí)；6：改良M9-3誘導(dǎo)2小時(shí)；7：改良M9-2誘導(dǎo)3小時(shí)；8：改良M9-2誘導(dǎo)2小時(shí)。

圖2中試不同起始誘導(dǎo)OD下目的蛋白表達(dá)電泳圖。1：Marker；2：誘導(dǎo)前；3，4：起始誘導(dǎo)OD600為0.5-1.0；3號(hào)罐誘導(dǎo)2～3hr；5～7：2號(hào)罐誘導(dǎo)1～3hr；8～10：3號(hào)罐誘導(dǎo)1～3hr。

圖3不同起始誘導(dǎo)OD₆₀₀下目的蛋白表達(dá)電泳圖。1：Marker；2～7：誘導(dǎo)1～6小時(shí)。

圖4不同培養(yǎng)基對(duì)高密度發(fā)酵的影響。1，6，1：Marke；2～5：改良M9高密度培養(yǎng)基2誘導(dǎo)0～3h；7～10：改良M9高密度培養(yǎng)基1誘導(dǎo)0～3h；12～16：改良M9-4培養(yǎng)基(基本沒(méi)表達(dá))。

圖5不同起始誘導(dǎo)OD₆₀₀對(duì)高密度發(fā)酵目標(biāo)蛋白表達(dá)影響SDS-PAGE電泳圖。1：誘導(dǎo)OD＝5誘導(dǎo)0小時(shí)；2：Marker；3～5：誘導(dǎo)OD＝5時(shí)誘導(dǎo)1～3h；6～9：誘導(dǎo)OD-10時(shí)誘導(dǎo)0～3h。

圖6搖瓶中不同培養(yǎng)基下目的蛋白表達(dá)電泳圖。1：Marker；2，3：1，2號(hào)瓶改良M9-4誘導(dǎo)3hr；4，5：3，4號(hào)瓶改良M9-3誘導(dǎo)3hr；6：誘導(dǎo)前。

圖7搖瓶中不同pH下目的蛋白表達(dá)電泳圖。1，9：Marker；2，10：誘導(dǎo)前；3：種子液對(duì)照；4-8：pH6.0-6.8；11-16：pH7.0-8.0。

圖8搖瓶中不同起始誘導(dǎo)OD下目的蛋白表達(dá)電泳圖。1，10：Marker；9，19：誘導(dǎo)前；2-8，11-18：不同起始誘導(dǎo)OD誘導(dǎo)3小時(shí)。

具體實(shí)施方式