[發明專利]酶法檢測直膽紅素試劑盒

有效

• 申請號: 200610025635.2
• 申請日: 2006-04-12
• 公開（公告）號: CN101055271A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 景晟
• 申請（專利權）人: 上海復星醫藥（集團）股份有限公司;上海復星長征醫學科學有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N33/72;C12Q1/26
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王巍

技術領域：

本發明屬于生物試劑技術領域。具體涉及一種酶法檢測直膽紅素試劑盒。

背景技術：

膽紅素是臨床上判定黃疸的重要依據，也是肝功能的重要指標。膽紅素總量增高、間接膽紅素增高表明：溶血性貧血，血型不合輸血，惡性疾病，新生兒黃疸等。直接與間接膽紅素均增高表明：急性黃疸型肝炎，慢性活動性肝炎，肝硬變，中毒性肝炎會導致膽紅素總量增高、直接與間接膽紅素均增高；膽紅素總量增高、直接膽紅素增高表明：肝內及肝外阻塞性黃疸，胰腺癌，毛細膽管型肝炎及其他膽汁瘀滯綜合癥。

正常血清總膽紅素濃度為1.7～17.1μmol/L，其中直接膽紅素低于3.4μmol/L。當總膽紅素達34μmol/L時，臨床上即可發現黃疸；如血清總膽紅素超過正常范圍而肉眼看不出黃疸，則稱為隱性黃疸，黃疸最常見于肝膽疾病，但其他系統疾病也可出現。

膽紅素(bilirubin)是血紅素的代謝產物，主要在肝臟內經結合作用轉化、排泄；它在血清中可以用三種形式存在：未結合膽紅素(BU，即游離膽紅素)、結合膽紅素(Bc：單葡萄糖醛酸Bcm和雙葡萄糖醛酸膽紅素Bcc之和)以及膽紅素(白蛋白共價連接膽紅素)。膽紅素為一種有效的抗氧化劑，具有捕獲氧自由基的能力，能保護脂類和脂蛋白不被氧化。它與人體內其它抗氧化防御系統育協同作用，與白蛋白結合后存在于心室的肌細胞部位，阻止該部位產生氧自由基，可調節心肌細胞的膽紅素抗氧化活性，保護心室肌細胞不受氧自由基損害。因此當膽紅素濃度降低時，冠心病的危險增加。

直接膽紅素測定的方法主要有重氮法、酶法和釩酸鹽氧化法。重氮試劑法歷史最久，目前為止仍應用最廣。最流行的有J—G法和M—E法。前者在膽紅素與重氮試劑反應后產生的重氮膽紅素使之在堿性條件下由紅色變成綠色。光譜的轉移增加了反應的靈敏度和特異性，在綠色環境中基本不干擾，但是這一改變增加了自動化的難度。因此采用該法往往只好手工操作。M—E法在重氮膽紅素生成后直接比色(紅色)，手續簡單，易于自動化是優點，但特異性差，溶血樣品的結果嚴重受擾。由于重氮法歷史悠久，醫學上有關膽紅素的各種論述均以本法為基礎。但是它存在缺陷：其一是重氮試劑不穩定，它必須由亞硝酸鈉和氨基苯磺酸臨時生成，生成后最多只能用2天(一般6小時)；其二是重氮試劑與間膽和直膽的反應特異性不佳，在一定條件下測直膽，一部分間膽參與反應，如果反應時間延長，參與的更多，導致測值的不準確。針對上述兩點，人們作過無數的改良，但至今仍無滿意的結果。而且該方法的操作繁復、試劑不穩定、反應不專一。

另外，化學氧化法，即使用化學氧化法測膽紅素的淵源很早，70年代就采用鐵氰化鉀除滴定法測鈣時的膽紅素干擾，以后也曾有報道用鐵氰化鉀法測總膽。但無論國內外也都只停留在方法學的探討上，而沒有實際應用價值。1993年日本學者To—kuda發表釩酸氧化法測血清中膽紅素。1998年該試劑盒，經臨床應用很快發展了眾多用戶，并獲得好評，認為該方法的線性、特異性與酶法的相關均達到比較理想的水平。膽紅素的四吡咯結構具有還原性，從理論上講各種低分子的無機氧化劑和在一定條件下具有氧化性的各種過渡金屬元素都可以氧化膽紅素，從而可用于測定膽紅素。但必須保證反應的專一性，還要周到地防止氧化反應的早、中、晚期可能出現的干擾和副反應。這類化合物除釩酸和亞硝酸鈉外還有過苯甲酸鈉、過硫酸鈉、乙酸錳(III)、硫酸銅、硫酸鐵等。因此發展這類方法還有廣闊的空間。這類方法的實用性已經得到證明，但進展不大。

從上述的比較來看，酶法測定膽紅素具有簡單、特異的特點。酶法氧化法較好，線性較寬、精密度高、受干擾較小。1988年Ot—suji報告一種新的測總、直膽酶法，其效果總膽也可以，直膽測定把pH降到3.7，并使用CuSO4作酶的促進劑，但該法也沒有被推廣。1990年1hara等報告在新生兒光療后的直膽測定中，酶法結果比重氮法明顯升高。經分析原因是光照后產生的光膽紅素酶法可分解，因而測值偏高，而重氮法則不。這種假性升高可能導致臨床上鑒別新生兒的生理或病理性黃疸時發生混亂。

因而，目前酶法測膽紅素技術雖然已能進入臨床應用.但還不完善，在直接膽紅素的測量過程中存在反應速度過慢，防止間接膽紅素的干擾性差，酶的活性下降快等等缺陷。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，提供一種加速直接膽紅素反應，提高試劑穩定性的酶法檢測直膽紅素的試劑。

本發明基于下列原理：

(1)選用有效的物質加速直接膽紅素的反應。其中酶的復合促進劑為HgCl2、十六烷基氯鉀氨、TrionX-405(表面活性劑)；