[發(fā)明專利]一種非抗生素篩選小麥轉(zhuǎn)基因植物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610019482.0
• 申請日: 2006-06-28
• 公開（公告）號: CN101096703A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖玉才;李和平;姚明鏡
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;A01H1/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種非抗生素篩選轉(zhuǎn)基因植物特別是一種小麥轉(zhuǎn)基因的方法，本發(fā)明的方法在轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化及篩選程序中不需要添加抗生素或除草劑，篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植物也不含抗生素或除草劑基因，因而對環(huán)境安全，是一種綠色轉(zhuǎn)基因植物方法。

背景技術(shù)

自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問世以來，植物基因工程取得了飛速發(fā)展。由于轉(zhuǎn)基因可以將有益基因?qū)耄罐D(zhuǎn)基因植物同時(shí)具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆境等多種優(yōu)點(diǎn)，全世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物的種類、產(chǎn)量都迅速增加。然而，隨著轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的商品化，轉(zhuǎn)基因植物可能對環(huán)境及人類健康帶來不良影響和損害的問題也日益突出，究其原因是由于人們對目前廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的抗性標(biāo)記基因的安全性心存疑慮。目前使用較多的標(biāo)記基因主要包括抗生素抗性基因和除草劑抗性基因。

抗性標(biāo)記基因的潛在危害主要表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)帶有抗生素或除草劑抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物對多種植物病原菌和除草劑具有抗性，有可能會轉(zhuǎn)變?yōu)橛泻﹄s草；(2)如果在轉(zhuǎn)基因植物種植區(qū)存在可與其雜交的近緣野生種雜草，轉(zhuǎn)基因植物中的除草劑抗性標(biāo)記基因可能會經(jīng)自然雜交轉(zhuǎn)移到這些近緣野生雜草中，從而形成現(xiàn)有除草劑無法殺滅的“超級雜草”；(3)標(biāo)記基因如果傳播到其它生物體中，可能會引起生態(tài)失衡，如產(chǎn)生超級害蟲；(4)存在于轉(zhuǎn)基因食品中的抗性標(biāo)記基因及其產(chǎn)物可能對人或動物的健康有害；(5)抗性標(biāo)記基因可能被轉(zhuǎn)移到人或動物腸道寄生菌中，使這些病原菌產(chǎn)生耐藥性，降低抗生素的治療作用。

中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)枮椋?7190983.0，美國孟山都公司)提出了一種名為“農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的可育小麥的方法及其相關(guān)組分”的專利，其發(fā)明要點(diǎn)是在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化小麥，需要在整個篩選程序中添加抗生素，以篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株；其不足之處是獲得的轉(zhuǎn)基因植株基因組中整合了抗生素基因，在小麥籽粒中表達(dá)累積的抗生素，直接進(jìn)入食物鏈中；同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株推廣種植過程中有可能將抗生素基因傳播到其它生物群體。

因此，轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因安全性問題一直是公眾關(guān)注的焦點(diǎn)，也是影響轉(zhuǎn)基因植物推廣應(yīng)用的主要難點(diǎn)。解決這一問題的主要途徑是開發(fā)、利用安全標(biāo)記基因，用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的篩選，培育對環(huán)境安全、無副作用的綠色優(yōu)良轉(zhuǎn)基因植物新品種。

以安全標(biāo)記基因?yàn)檫x擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不同，它不是將非轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死，而是使轉(zhuǎn)化細(xì)胞處于某個有利的代謝條件下，從而篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這種選擇系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)在于選擇劑無毒副作用，而且在多數(shù)情況下有利于轉(zhuǎn)化植株的再生，從而提高轉(zhuǎn)化率。以糖代謝酶基因?yàn)闃?biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，利用糖類作為篩選劑，根據(jù)植物細(xì)胞糖代謝能力的差異進(jìn)行選擇，即轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于獲得了糖代謝能力而在篩選培養(yǎng)基上生長擴(kuò)增，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞因?yàn)椴荒苷４x處于饑餓狀態(tài)，生長被抑制但不被殺死，從而區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種不需要抗生素進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化，并能夠快速準(zhǔn)確篩選鑒定轉(zhuǎn)基因植物的新方法。本方法由于不添加對環(huán)境及人畜具有潛在危害的抗生素或除草劑，而且能直接鑒定基因表達(dá)產(chǎn)物的功能，因此是一種快速、準(zhǔn)確、低成本、對人畜及環(huán)境安全的篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因小麥植物的方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)基因植物的方法，其步驟包括PCR、基因克隆、載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的要點(diǎn)是，通過農(nóng)桿菌將外源基因?qū)胨鲋参铮梅强股馗事短翘娲股刈鳛檫x擇劑，在小麥幼穗、幼胚作為轉(zhuǎn)化受體的愈傷組織分化、再生和壯苗步驟中，將所述的選擇劑按照由低到高的添加量分別添加到基本培養(yǎng)基中，篩選得到轉(zhuǎn)基因植株；通過PCR檢測和酶活性鑒定得到所述的轉(zhuǎn)基因植株。

具體步驟如下：

1)根據(jù)Genebank公布的序列，設(shè)計(jì)一對大腸桿菌manA基因特異引物，該引物的編號及結(jié)構(gòu)如下：PMIP1：5’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’和PMIP2：5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’，用于從大腸桿菌基因組中PCR擴(kuò)增manA基因，測序后作為選擇標(biāo)記基因用于構(gòu)建植株表達(dá)載體pMBL5，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。

2)將培養(yǎng)的外植體如小麥幼穗及幼胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，從外植體誘導(dǎo)出所需要的愈傷組織；

本發(fā)明制備了以下兩種專用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以適應(yīng)不同外植體的需要：