[發(fā)明專利]發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610010330.4
• 申請日: 2006-07-27
• 公開（公告）號: CN101113976A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發(fā)明（設計）人: 金濤
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: G01N30/90
• 分類號: G01N30/90;G01N21/33;G01N1/28
• 代理公司: 哈爾濱東方專利事務所
• 代理人: 陳曉光

技術領域：

本發(fā)明涉及一種發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法。

背景技術：

紫杉醇類化合物是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中分離得到的二萜類化合物的總稱，其中尤為引人注目的是紫杉醇，其他二萜類化合物一般也具有紫杉醇母核結構，有些是紫杉醇生物合成的前體物，并且可以人工合成為具有藥用價值的新化合物，紫杉醇能夠與細胞微管蛋白結合，阻止微管解聚，有效地控制癌細胞的快速分裂和增殖，作為一種作用機制獨特的抗癌新藥，自問世以來一直受到人們的重視，但由于紫杉醇在天然紅豆杉中的含量很低，加上紅豆杉資源有限，因此限制了紫杉醇的進一步開發(fā)應用，為了解決這個問題，近些年來科學家們在尋找及擴大紫杉醇藥源途徑上進行了大量的工作，其中包括化學合成、生物技術及利用共生菌發(fā)酵生產等，由于微生物發(fā)酵法生產紫杉醇具有十分巨大的經濟效益和廣闊的開發(fā)空間，所以是一種十分有前途的紫杉醇生產方式，而對微生物發(fā)酵法生產紫杉醇研究過程中即涉及紫杉醇類化合物的測定，需要使用高效液相儀等昂貴設備，使菌種鑒定和含量測定方法復雜，成本較高。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單的發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量測定方法。

上述的目的通過以下的技術方案實現：

一種發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法，將發(fā)酵產物用乙酸乙酯萃取，減壓蒸干得固形物，用20％甲醇水溶液溶解，經201×4樹脂吸附后，用80％甲醇水溶液洗脫；將洗脫液減壓蒸干用定量甲醇溶解得供試品溶液；按照薄層色譜法，定量吸取供試品溶液和紫杉醇對照品，點樣于硅膠H薄層板上進行層析，以氯仿甲醇體積比6∶1為展開劑，至薄層板上端1厘米處，取出晾干，用1％香草醛濃硫酸溶液將紫杉醇對照品顯色，供試品展層部位蓋上，刮取與對照品Rf值相同部位上下0.5厘米處的硅膠，用定量甲醇洗脫，在240nm處測定其紫外吸光值，由紫杉醇濃度與240nm得到的吸光值之間作得的標準曲線查出供試樣品濃度，根據稀釋倍數記算出原發(fā)酵液中紫杉醇類化合物的含量。

上述的發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法，所述的樹脂為201×4樹脂。

上述的發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法，所述的薄層色譜方法展開劑為氯仿與甲醇體積比6∶1的氯仿甲醇溶液。

上述的發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法，所述的紫外線吸收波長為240nm。

這個技術方案有以下有益效果：

1.本發(fā)明方法，涉及的分析試材廉價易得、成本較低，是一種簡便、耗時較少的發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法。

2.本發(fā)明方法與高效液相法相比較成本較低，高效液相法需要至少十幾萬以上的設備，保養(yǎng)復雜，操作人員要求素質教高，人員培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)成本較高，而本發(fā)明方法采用薄層法與紫外分光光度法相結合，僅需要萬元左右設備，操作人員能夠很容易地掌握操作方法，操作人員要求素質不高，培養(yǎng)成本較低。

3.本發(fā)明方法在每次操作過程中，應用薄層法與紫外分光光度法相結合的方法測定含量后，樣品可以回收不會損失樣品，這對于提取復雜而價格貴于黃金的紫杉醇類藥物來講意義重大，高效液相法操作一年后，為了保證好的柱效和分析結果，需要更換價格昂貴的高效液相柱，而薄層法與紫外分光光度法相結合的方法不需要這樣的更換費用。

4.本發(fā)明方法，薄層法與紫外分光光度法相結合的測定方法普通實驗室即可滿足測定條件，隨時隨地可以檢測，容易普及。

本發(fā)明的具體實施方式：

實施例1：

發(fā)酵液中紫杉醇類化合物含量的簡易測定方法，發(fā)酵液過濾，菌絲體研磨破壁稱重，以1g菌絲體加5ml乙酸乙酯(V/W)比例進行萃取，澄清濾液用同等液體體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，50℃減壓蒸干得固形物，用2毫升甲醇洗滌減壓干燥的固體，0℃密封保存或測定。取適量硅膠G用水調勻，涂布于20cm長的玻璃板上晾干，105℃活化30分鐘后備用。按照薄層色譜法，定量吸取20微升供試品溶液和5微升紫杉醇對照品，點樣于硅膠H薄層板上進行層析，以氯仿甲醇體積比6∶1為展開劑，至薄層板上端1厘米處，取出晾干，用1％香草醛濃硫酸溶液將紫杉醇對照品顯色，而供試品展層部位蓋上，防止被顯色劑破壞，刮取與對照品Rf值相同部位上下0.5厘米處的硅膠，用2毫升甲醇洗脫，過濾得上清液，在240nm處測定其紫外吸光值，根據紫杉醇濃度與240nm得到的吸光值之間作得的標準曲線查出供試樣品濃度，根據稀釋倍數記算出原發(fā)酵液中紫杉醇類化合物的濃度。

實施例2：