[發明專利]用于結合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制備和使用方法

無效

• 申請號: 200580040222.5
• 申請日: 2005-11-17
• 公開（公告）號: CN101065665A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: A·G·弗魯托斯;J·拉希瑞
• 申請（專利權）人: 康寧股份有限公司
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N33/543
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 沙永生

????????????????????????與相關申請的交叉參考

本申請要求2004年11月24日提交的、發明名稱為“用于結合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制備和使用方法”的美國專利申請10/996,952的優先權，該申請以引用的方式納入本文。

???????????????????????????????背景技術

采用不依賴于標記的檢測(label?independent?detection，LID)平臺(例如表面等離子共振(SPR)或共振光柵傳感器(resonant?grating?sensors))的試驗通常以兩步法進行：(i)將結合伴侶之一(通常是蛋白質)固定在傳感器表面上；和(ii)將配體(藥物、蛋白質、寡核苷酸等)結合在固定的蛋白質上。傳統上，將生物分子偶聯于表面包括把表面上的羧酸基團活化成反應性N-羥基琥珀酰亞胺((NHS))酯，然后將其偶聯于感興趣蛋白質上的氨基基團。Biacore，AffinityBiosensors和Artificial?Sensing?Instruments在他們各自的LID平臺上成功應用該方法并將其商業化。雖然該方法很有效，但是活化步驟很耗費時間并且包括處理和使用具有一定毒性的化學品。

該方法的一種替代方法包括使用“預活化”化學物質。例如，已采用提供醛基的表面來結合生物分子。然而，偶聯之后需要還原步驟來穩定產生的希夫堿。也采用了具有環氧化物和異氰酸酯官能團的表面；然而，環氧化物基團反應相對較慢，因此需要在堿性很強的條件下孵育很長時間，而異氰酸酯基團反應性極強，因此帶來了儲存穩定性方面的問題。因為這些問題，將預活化化學物質用于LID平臺的報道很少見到。實際上，提供最流行的LID平臺的三家公司-Biacore、AffinityBiosensors和ASI，提供的傳感器都沒有采用預活化化學物質(chemistry)。

馬來酸酐易與親核物質如氨基發生反應。雖然已描述了用馬來酸酐共聚物層來修飾表面以固定小分子、DNA、糖和肽(1-9)，但由于馬來酸酐的水解穩定性很差(10)，它們沒有得到廣泛應用。馬來酸酐與疏水側鏈(例如苯乙烯)共聚可增加馬來酸酐的水解穩定性；然而，這會導致生物分子與表面的非特異性結合的問題。雖然這對于某些應用(如質譜)而言是一個優點，但對于LID來說則是一個問題。

大體而言，對于LID檢測有一個獨特的問題，即要求嚴格的生物特異性。不希望“阻斷劑”(例如牛血清白蛋白，BSA)摻入分析物溶液中，因為特異性(由分析物引起)和非特異性(由阻斷劑引起)結合均會導致界面折射率的變化，因此不能區分二者。當采用復雜的樣品或者分析物不純時，這個問題只會更加嚴重。對于用酸酐固定蛋白質的一個憂慮是由于形成殘余負電荷以及聚合物中其它基團(例如苯乙烯、乙烯、甲基乙烯基醚等)的影響而導致的非特異性結合。因為這些原因，將酸酐聚合物用于LID的可行性也是一種潛在憂慮。這種憂慮以及酸酐基團的潛在穩定性問題是現有技術中還不知道或未描述將酸酐共聚物用于LID的一個原因。本發明描述了如何成功地將馬來酸酐聚合物用于LID試驗中。通過適當選擇聚合物中的側鏈和固定條件，這些結合試驗可具有很高的特異性，同時保持足夠的水解穩定性。而且，本發明公開了可在酸性(pH＜7)條件下將很多生物分子固定在馬來酸酐共聚物表面上，同時相對于更加常規的肽偶聯條件(pH7-9)，具有水解穩定性增加和蛋白質結合增加量等優點。

采用3D基質固定可以固定更大量的生物分子，因此提供了更多的結合位點。水凝膠如羧甲基葡聚糖是最常用的(32-34)。對于水凝膠的一個憂慮是在鄰近表面的水凝膠中大分析物分子與結合位點的分離。相對于采用熒光顯微鏡等技術的常規檢測，由于LID檢測的瞬逝電磁場的指數性質，結合信號迅速從表面消失。本文描述的聚合物表面不如水凝膠厚，因此，固定發生在離界面更近的地方，這可防止在后續的結合研究中發生分離。

本文描述了用能夠結合一種或多種生物分子的一種或多種聚合物涂覆的基材，及其制備和使用方法。使用這種涂覆的基材的方法相對于現有技術提供了多種優點。例如，這種基材不需要活化，從而節省了用戶的時間、成本并降低了操作的復雜性。此外，這種涂覆的基材的制備方法允許大規模制備這種基材。一般，這種涂覆的基材具有穩定性，可儲存較長的時間(～6個月)而其結合能力很少或不喪失。而且，這種涂覆的基材在酸性條件下水解緩慢，這允許在現有聚合物(例如酸酐聚合物)技術沒有描述過的條件下結合各種生物分子。

??????????????????????????????發明概述