[發明專利]用于質粒DNA發酵的工藝

無效

• 申請號: 200580034956.2
• 申請日: 2005-08-16
• 公開（公告）號: CN101076597A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發明（設計）人: 亞倫·E·卡奈斯;詹姆士·A·威廉姆斯
• 申請（專利權）人: 自然科技公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司
• 代理人: 陶貽豐;鄭霞

關于聯邦資助研究或開發的聲明

不適用

本申請要求2004年8月19日提交的臨時專利申請序號#US60/603000的權益。

技術領域

本發明涉及共價閉合環狀(ccc)重組DNA分子如質粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、噬菌體、病毒載體及其雜交體的生產，特別是一種在發酵培養中高水平地生產所述DNA分子的方法。

發明背景

本發明涉及共價閉合環狀(ccc)組合DNA分子的生產。這種分子在生物技術、轉基因生物體、基因治療、治療性接種、農業和DNA疫苗中是有用的。

考慮到本發明，對現有技術進行了檢索。大腸桿菌質粒早已經成為研究人員和業界使用的、唯一最重要的重組DNA分子來源。如今，隨著下一代生物技術產品(基因藥物和DNA疫苗)進入臨床試驗并最終進入醫藥市場，質粒DNA正變得愈發重要。質粒DNA疫苗可能尋求應用為用于病毒性、細菌性或寄生蟲性疾病的預防疫苗；用于制備高免疫球蛋白產品的免疫劑；用于感染性疾病的治療疫苗；或者作為癌癥疫苗。質粒也可用于基因治療或基因替換應用，其中，在對患者給藥后從該質粒表達想要的基因產品。

現今，除了基本形式之外尚未規定FDA標準(參見：FDA關于用于預防感染性疾病適應癥的質粒DNA疫苗的意見，1996)。但是，在某一天，質粒DNA純度的國際標準可能相同于或非常相似于用于類似從大腸桿菌發酵生產的重組蛋白產品的那些，而且這樣的標準超出了從已建立方法可獲得的當前純度。更引人注目地，可接受的標準——每劑量＜100pg宿主基因組的DNA(參見：FDA關于用于生產生物的細胞系表征的意見，1993)低于當前可得到的純化質粒制品的水平(每1mg劑量100pg相當于每一千萬分之一)。

用于獲得質粒(通過細菌發酵)及其純化(例如，通過堿裂解法(Birnboim，HC，Doly?J.1979，Nucleic?Acids?Res.7：1513-1523))的基本方法是眾所周知的。初始地，將已發酵的細菌細胞膏再懸浮和裂解(應用氫氧化鈉和十二烷基硫酸鈉的組合)，然后通過加入酸的鹽(例如，醋酸鉀)來中和該溶液，使細菌DNA和多數細胞碎片沉淀。大量的超螺旋質粒DNA保留在溶液中，并帶有污染的細菌RNA、DNA和蛋白質，以及大腸桿菌內毒素(脂多糖，或LPS)。然后通過過濾分離到可溶的部份并進行各種純化步驟，其可包括：核糖核酸酶消化；色譜法(離子交換凝膠過濾，羥基磷灰石，凝膠過濾，疏水作用，反相，HPLC，等)；滲濾；有機提取，選擇性沉淀，等等。

明顯地，提高原料的純度和獲得較好下游純化是產業規模化制造臨床級別DNA的基本目標。

發酵培養基的考慮

平衡培養基的設計是基于細胞能量要求和元素組成。一般地，以基本培養基或半合成培養基來滿足營養的要求。

半合成培養基含有復合成分如酵母提取物、酪蛋白氨基酸、蛋白胨。復合成份的添加供給了生長因子、氨基酸、嘌呤和嘧啶且經常支持更高的細胞密度。

碳占一半的細胞組成。因此，碳屬于最高的數量。碳源提供能量和生物量，而且常常被用作限制性營養物。葡萄糖是常規的碳源。它被非常有效地代謝，并因此給予更高的細胞產率。但是，由于代謝溢流(稱為克雷布特里效應)，高濃度的葡萄糖導致不想要的醋酸鹽產物。也可使用甘油，而且在分批培養基中它經常是優選的碳源。盡管從甘油獲得的細胞產量略為少于從葡萄糖獲得的，但是甘油不會引起那么高水平的醋酸鹽產物，而且可以較高濃度使用而無抑制性。甘油還支持降低最大特異性生長速率。

用無機或有機氮源可以滿足氮的要求。氨水和銨鹽(例如，NH₄Cl，(NH₄)₂SO₄)可用于基本培養基。半合成培養基從復合成份，包括酵母提取物、酪蛋白氨基酸和蛋白胨，部分或者全部地提供氮。

礦物質是生長、代謝和酶反應所必需的。一般鎂、磷、鉀和硫作為獨特的培養基成份而被添加。磷酸二鉀和單鉀鹽提供了鉀和磷，而且還具有一定比例的緩沖劑功能。硫酸鎂七水合物常被用作鎂和硫的來源。其它基本礦物質包括鈣、銅、鈷、鐵、錳、鉬和鋅。這些都需要較小的數量，而且常通過添加痕量礦物質溶液來提供，盡管它們通常作為主成分中雜質而存在。用氯化鈉調節摩爾滲透壓(osmolarity)。