[發明專利]培養人胚胎干細胞

無效

• 申請號: 200580029937.0
• 申請日: 2005-09-08
• 公開（公告）號: CN101052712A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: J·A·湯姆森;T·路德維格
• 申請（專利權）人: 威斯康星校友研究基金會
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;C12N5/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 余穎

?????????????????????相關申請的交叉參考

本申請要求2005年6月29日提交的美國臨時專利申請序列號60/695,100以及2004年9月8日提交的美國臨時專利申請序列號60/608,040的優先權。

?????????????????關于聯邦政府資助研究或開發的聲明

本說明書中描述的一些工作受到美國政府撥款資助，而一些工作未獲得資助。本說明書中所述的關于衍生新的人胚胎干細胞系的方法的工作未受到美國政府任何撥款資助。本發明在一定程度上是利用下述機構授予的美國政府資助下完成的：NIHRR017721。美國政府對本發明享有一定權利。

?????????????????????????????發明背景

干細胞被定義為能夠分化成許多其它分化細胞類型的細胞。胚胎干細胞是來自胚胎的干細胞，能夠分化成大多數，如果不是全部，成熟機體的分化細胞類型。干細胞被稱為是多能的，這是指它能夠分化成許多細胞類型。一類受到研究機構高度關注的多能干細胞是人胚胎干細胞，這里簡稱為人ES細胞，這是一種來自人胚胎來源的胚胎干細胞。人胚胎干細胞由于能夠在培養基中無限增殖并由此而能夠(至少原則上能夠)提供細胞和組織以替代缺陷或受損的人組織而受到極大科學關注。人胚胎干細胞培養物的存在有可能提供無限量的人細胞和組織以用于各種有助于人體健康的治療方案和研究計劃。可以想像，在未來，將能夠增殖人胚胎干細胞并使其定向分化成特定譜系以產生出于治療目的可移植入人體的分化的細胞或組織。

已經描述了產生和培養人胚胎干細胞的基礎技術。現有技術的確有效，但一些目前用來培養人胚胎干細胞的方法有限制和缺點。一種限制意義特別重大。大多數現有人胚胎干細胞系在一定程度上或在其它程度上已經直接暴露于小鼠細胞或暴露于其中已經培養過小鼠細胞的培養基。發現來自現有細胞系的一些人ES細胞展示出人類細胞通常不產生的唾液酸殘基Neu5Gc，這一事實倍受關注。最初的產生和培養人胚胎干細胞的技術要使用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養細胞作為飼養層，在該飼養層上可培養人胚胎干細胞。成纖維細胞飼養層通過一些仍不十分清除的機制使得干細胞能夠保持在未分化狀態。隨后發現，如果使干細胞接觸“調理培養基(conditionedmedium)”也能獲得相同的現象。調理培養基無非就是已經培養過飼養細胞(如MEF)的干細胞培養基。無論飼養細胞是能賦予培養基某些因子還是能從培養基中除去某些因子，其結果都是調理培養基可用來培養干細胞使其不發生分化。任何一種培養條件，即人ES細胞直接在鼠飼養細胞上生長或使用調理培養基都涉及這樣的問題，即一種或多種試劑如病毒能從小鼠細胞傳遞到人ES細胞。如果培養人胚胎干細胞的一個目的是產生最終可植入人體的組織，就高度需要干細胞從未暴露于其它物種的細胞或者暴露于曾用來培養其它物種的細胞的培養基。因此，在長期培養人胚胎干細胞技術的持續發展中最感興趣的是找到能增殖和培養人胚胎干細胞但不含成纖維細胞飼養層的培養條件。

一些培養基配方能夠在一段時間內使人ES細胞維持未分化狀態，但長期培養時將不能維持這種狀態。具體地說，我們定義來自最初的種子培養物的人ES細胞培養板上生長至細胞鋪滿該相同的培養容器為一個“傳代”。我們發現一些培養基配方允許培養人ES細胞一或兩個傳代不發生嚴重分化，但在隨后的傳代中細胞迅速分化。我們已經開始相信，為得到確實能夠支持人ES細胞無限增殖而不分化且不含飼養細胞或調理培養基的培養基，培養基必需支持培養人ES細胞處于基本均勻且未分化狀態至少5代。培養物在培養期間維持相對同質和未分化并保留人ES細胞所有重要特征也是重要的。

培養中的人胚胎干細胞的一個特有性狀是，如果條件不夠理想，這種細胞則有分化趨勢。當在培養時過分要求維持人ES細胞處于未分化狀態時則容易誘導人ES細胞分化。大多數培養條件將導致一定水平不希望的分化，尤其是在正在生長的ES細胞集落邊緣周圍。盡管培養ES細胞時可以有一定程度不希望的分化，但目的是定義能夠盡可能使培養物維持未分化即得到盡可能少的分化細胞的培養條件。我們認為，我們已經采用特別嚴格的標準來定義將支持無限培養未分化的ES細胞培養物的條件。