[發明專利]利用3－氨基－5－羥基苯甲酸(AHBA)合酶基因保守序列篩選安莎類化合物的方法

無效

• 申請號: 02125509.1
• 申請日: 2002-07-17
• 公開（公告）號: CN1398986A
• 公開（公告）日: 2003-02-26
• 發明（設計）人: 王以光;高群杰
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所
• 代理人: 楊厚,王為

1、利用AHBA生物合成基因保守序列篩選安莎類化合物的方法，其特征是所說的方法包括以下步驟：

1)AHBA生物合成基因的克隆；

2)吸水鏈霉菌17997中AHBA基因簇的確定：

3)吸水鏈霉菌17997中萘醌型安莎類化合物生物合成基因的分析；

4)吸水鏈霉菌17997中萘醌型安莎霉素生物學活性測定。

2、如權利要求1所述的方法，其特征是在對NCBI數據庫中所有登錄含AHBA結構的抗生素AHBA生物合成編碼序列分析基礎上，根據其氨基酸序列的保守區設計一對簡并引物：

????上游引物為??5’-AGAGGATCCTTCGAGCRSGAGTTCGC-3’

????????????????????????BamH1

????下游引物為??5’-GCAGGATCCGGAMCATSGCCATGTAG-3’

以吸水鏈霉菌17997基因組DNA為模板，在LATag酶作用下進行PCR反應，獲得755bp產物，將其擴增產物與含AHBA結構的相關抗生素進行同源性比較，確證為AHBA基因片段。

3、如權利要求1或2所述的方法，其特征是以755bpPCR產物為探針，選擇高嚴謹度的雜交條件與吸水鏈霉菌17997柯斯質粒基因文庫進行菌落雜交及Southern雜交，獲得陽性克隆，經測序并與NCBI數據庫進行同源性比較及保守序列分析，確定負責geldanmycin生物合成的基因簇(pCGBA10)和負責未知的萘醌型安莎類抗生素生物合成的基因簇(pCGBA3)。

4、如權利要求1或3所述的方法，其特征是通過對pCGBA3柯斯質粒中的外源片段序列分析，確定其中含有編碼萘醌型安莎霉素生物合成的10個開放閱讀框架(ORF)，分別編碼與AHBA生物合成相關酶：AHBA合酶、磷酸化酶、氧化還原酶、氨基脫氫奎尼酸合成酶及與安莎霉素合成相關酶I型聚酮合酶及酰胺合酶。

5、如權利要求1或4所述的方法，其特征是利用基因阻斷技術破壞吸水鏈霉菌17997中負責格爾德霉素生物合成基因，以檢測該菌產生的另外一個萘醌類安莎霉素的生物學活性，具體步驟是將吸水鏈霉菌17997中與格爾德霉素生物合成相關序列插入質粒載體如噬菌體載體KC515，構建重組質粒，轉染17997孢子，獲得溶源菌，分離提取溶源菌總DNA，用限制性酶(如BamHI)酶切后，以載體上標記如KC515載體上硫鏈絲菌素抗性標記基因為探針，進行Southern雜交分析，證明溶源菌中所含與格爾德霉素生物合成相關基因已和載體一起整合至染色體，致使格爾德霉素生物合成基因受到破壞，以單純皰疹病毒1型感染的VERO細胞為模型，測定溶源菌發酵液對病毒的活性。

6、利用AHBA生物合成基因保守序列，篩選安莎類化合物的方法的思路，在篩選其它類有生物學活性化合物中的應用。