[發明專利]生物發酵提純苦馬豆素工藝

無效

• 申請號: 02114591.1
• 申請日: 2002-05-24
• 公開（公告）號: CN1396263A
• 公開（公告）日: 2003-02-12
• 發明（設計）人: 童德文;曹光榮;趙寶玉;葛鵬斌
• 申請（專利權）人: 楊凌大農生物技術有限公司
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;//;C12R1645)
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 李鄭建

一、所屬領域

本發明屬于生物工程研究領域，具體涉及生物發酵，生物制藥，天然產物提取、分離和鑒定方法，特別涉及一種生物發酵提純苦馬豆素工藝。

二、背景技術

關于苦馬豆素的來源有三種途徑：①從植物中提取分離，目前已經知道含苦馬豆素的植物主要是豆科黃芪屬和棘豆屬植物(瘋草)，這類植物廣泛分布于世界各地，尤其是北美和我國，資源十分豐富；其次是豆科苦馬豆屬植物，該屬植物僅局限于澳大利亞。②從豆類絲核菌(Rhizoctonia?leguminicola)中提取分離。Schneider等(1983)首次從豆類絲核菌中分離出苦馬豆素。③人工合成苦馬豆素。鑒于苦馬豆素及其相關化合物在生物化學、免疫學、醫學和毒理學等方面的眾多用途，美國的化學家Yasuda(1984)、Bennett(1989)和我國科學院院士周維善先后對苦馬豆素人工合成進行了研究。由于苦馬豆素有4個手性碳原子，即使很好地控制反應，但是合成的產物中還有16個化學結構相同，而立體構象不同的異構體，要使之分離卻十分困難，整個合成過程有21步，產率僅為6.6％。

國內在苦馬豆素提純方面的研究起步較晚。從80年代中期相繼發現甘肅棘豆、小花棘豆、莖直黃芪、寬苞棘豆、變異黃芪等瘋草類植物也含有苦馬豆素。

國外分離提純苦馬豆素的主要來源有2種途徑①從瘋草中提純；②從豆類絲核菌(Rhizoctonia?leguminicola)中提純。分離技術工藝是先將植物樣品或菌絲體在有機溶劑中浸提，再經過陽離子交換柱和瓊脂糖凝膠柱，最后重結晶獲得苦馬豆素純品。國內提純苦馬豆素主要來源于瘋草類植物，由于植物中苦馬豆素含量很低，使得在提純的主要技術研究方面尚屬空缺，若人工合成，則成本很高。

三、發明內容

針對上述現有技術中存在的缺陷或不足，本發明的目的在于，提供一種采用生物發酵提純苦馬豆素工藝。

為了實現上述目的，本發明的生物發酵提純苦馬豆素工藝通過豆類絲核菌7-3生物發酵，使提取所用的原材料中苦馬豆素得以富集，在采用陽離子交換柱層析、硅膠柱層析，分段升華等技術獲得苦馬豆素。利用生物發酵系統從已篩選確定的豆類絲核菌中提純苦馬豆素，使苦馬豆素原材料來源更為便利，有利于工廠化批量生產，使生產成本大幅度降低。最終為促進苦馬豆素在抗腫瘤藥物及免疫增強劑等方面的產業化提供物質保障。

本發明的生物發酵提純苦馬豆素工藝，具體工藝如下：

1)豆類絲核菌7-3保存：自行分離的豆類絲核菌7-3?PDA培養基接種，4℃冰箱保存，每20天～30天傳代一次；

2)豆類絲核菌7-3接種、培養與菌絲體收集：在無菌狀態下，將7-3菌種接種于生物發酵用Czapek’s培養基，25℃～27℃通氣培養2周，收集菌絲體，干燥，備用；

3)豆類絲核菌中苦馬豆素的提純：按下列工藝進行：

第一步，將豆類絲核菌菌絲體100g～1000g置入80～95％乙醇溶液1000～5000mL，提取乙醇提取液并分離殘留物；

第二步，H₂O∶CH₂CL₂100～1000mL萃取CH₂CL₂液，回收CH₂CL₂，將水提取液調pH10.0再用H₂O∶CH₂CL₂100～1000mL萃取，分離二氯甲烷層；

第四步，將水層揮發至干，得到總生物堿5g～50g；

第五步，將得到總生物堿進行減壓梯度升華，最后得到苦馬豆素純品1.5mg～15mg。本發明的另外的特點是，所述PDA培養基的配方組成為：去皮馬鈴薯200g～2000g，瓊脂15g～150g，葡萄糖20g～200g，水1000ml～10000ml；

所述Czapek’s培養基的配方組成為：蔗糖30g～300g，硝酸鈉3g～30g，磷酸氫二鉀1.3g～13g，硫酸鎂0.5g～5g，氯化鉀0.5g～5g，硫酸亞鐵0.01g～0.1g，酵母浸膏3g～30g，水1000ml～10000ml。

四、附圖說明

圖1是本發明的具體工藝路線流程圖；

圖2是本發明的提純工藝圖。

五、具體實施方式

為了更清楚的理解本發明，以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細描述。