[發(fā)明專利]抗人肝癌單克隆抗體HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 02114471.0
• 申請日: 2002-03-15
• 公開（公告）號: CN1381461A
• 公開（公告）日: 2002-11-27
• 發(fā)明（設計）人: 陳志南;邢金良;張思河
• 申請（專利權）人: 陳志南
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07K16/44;C12N15/11;C12P21/08;A61K39/395;A61P35/00
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技術領域

本發(fā)明涉及抗人肝癌單克隆抗體HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因和由所述基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應用。

背景技術

肝癌是我國和東南亞地區(qū)的多發(fā)病和常見病。尤其在我國，每年死亡人數(shù)高達11萬人。約占全世界肝癌總死亡人數(shù)的43％，因此研究肝癌的診斷和治療具有重要的意義。自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)建B淋巴細胞雜交瘤技術以來，各種單克隆抗體(McAb)相繼出現(xiàn)，它們在疾病診治的基礎研究和臨床應用方面發(fā)揮了積極的作用，其中肝癌單抗的研制更是為這種難治性腫瘤帶來了新的希望。近二十年，關于肝癌單抗的研究大多為甲胎蛋白和鐵蛋白單抗。在肝癌單抗的制備方面，多采用傳統(tǒng)免疫方法，即以可溶性物質(zhì)或肝癌培養(yǎng)細胞為免疫原，由于腫瘤抗原的變異或部分丟失，因而該方法難以獲得高親和性、高特異性的肝癌單抗。

用腫瘤新鮮組織制備細胞懸液免疫動物制備單抗已有成功報道。該法雖然篩選麻煩，但能較好地保持抗原性，不失為免疫動物制備單抗的好方法。本發(fā)明人用該免疫方法獲得特異性肝癌單抗7株，該細胞株的建立見《單克隆抗體通訊》，1989；2：33-36，陳志南，劉彥仿，楊繼震等。其中特異性較好的HAb18肝癌單抗，免疫組化染色陽性率為75％，已通過了中國藥品生物制品檢定所的《人用鼠源性單克隆抗體制備及質(zhì)量控制要點》的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的在于提供一種抗肝癌相關抗原HAb18G的單克隆抗體HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，以便兩者重組后可表達出特異性識別和結合肝癌相關抗原HAb18G的抗體活性片段。

本發(fā)明的另一目的在于所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應用。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及一種抗肝癌相關抗原HAb18G的單克隆抗體HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。本發(fā)明的抗肝癌單抗HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因是從能夠分泌較高活性的鼠源性抗HAb18G單抗的雜交瘤細胞株HAb18中克隆的。其中所述的重鏈可變區(qū)基因全長為445bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中<400>3所示。所述的輕鏈可變區(qū)基因全長為421bp，其核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，兩個基因重組后可用于表達特異性識別和結合肝癌相關抗原HAb18G的抗體活性片段。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還涉及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應用。

本發(fā)明人應用一套設計的引物成功地從培養(yǎng)的肝癌特異性單抗HAb18雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。序列分析表明，VH基因與Kasturi，K.N等發(fā)表的抗胸腺細胞和紅細胞自身抗體的重鏈可變區(qū)基因同源性最高。VL基因與O′Connor，K.C.等發(fā)表的抗DNA抗體6E6的輕鏈可變區(qū)基因的同源性最高，屬于小鼠免疫球蛋白重排的κ鏈V-J區(qū)基因。所得VH與VL基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)?；谏鲜鲆芽寺〉降目谷烁伟﹩慰笻Ab18輕、重鏈可變區(qū)基因，可以采用基因工程方法，構建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、嵌合抗體、Fab抗體等，以便用于肝癌的診斷和治療目的。

附圖說明

圖1為RT-PCR擴增的抗人肝癌單抗HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中A為DL-2000Marker，B為HAb18重鏈可變區(qū)基因，C為HAb18輕鏈可變區(qū)基因。

圖2為抗人肝癌單抗HAb18輕鏈可變區(qū)基因的測序圖譜。

圖3為抗人肝癌單抗HAb18重鏈可變區(qū)基因的測序圖譜。

具體實施方式

抗人肝癌單抗HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆。

所用細胞株為第四軍醫(yī)大學細胞工程研究中心采用傳統(tǒng)的融合方法獲得的一株高親和力、高特異性的鼠源性抗人肝細胞癌單抗HAb18雜交瘤細胞株，其抗原為HAb18G分子，其分泌的抗體分子亞型為IgG₁

抗HAb18G的單抗可變區(qū)基因的克隆