[發(fā)明專利]一種家畜口蹄疫病毒基因工程苗及其制造方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01111121.6
• 申請日: 2001-03-17
• 公開（公告）號(hào): CN1319670A
• 公開（公告）日: 2001-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘安清;秦智鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市三方圓信息技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/34
• 分類號(hào): C12N15/34;C12N15/42;C12N15/63;C12N15/74;C12N15/83;A61K39/135;A01H1/00;A01H5/00
• 代理公司: 深圳市專利服務(wù)中心
• 代理人: 王雄杰

本發(fā)明涉及一種家畜口蹄疫病毒基因工程苗及其制造方法，更具體地說，涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器來制造口蹄疫病毒基因工程苗的方法及其產(chǎn)品。

在現(xiàn)有技術(shù)中，用植物作表達(dá)載體來表達(dá)外源蛋白已有不少報(bào)道，病毒蛋白、細(xì)菌毒素和抗體分子己在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)，且絕大部分表達(dá)蛋白具有完全的抗原功能或標(biāo)識(shí)功能。重要的是，它們同免疫基因一樣可激發(fā)特異性的免疫應(yīng)答，在開發(fā)疫苗過程中，用植物表達(dá)免疫基因，必將是常規(guī)疫苗的經(jīng)濟(jì)替代品。口蹄疫病毒(FMDV)極大影響肉和奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。用滅活苗廣泛免疫易感動(dòng)物已非常成功，是防制此病的有效工具，但疫苗廠家具有散毒的危險(xiǎn)，而且免疫效果較好的弱毒苗具有“返祖”現(xiàn)象，給口蹄疫的根除帶來極大的困難。因此，要徹底地控制和消滅此病，必須開發(fā)一種安全、高效的替代品。研究表明：FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1攜有典型的抗原決定簇，可誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生。用VPI蛋白或其部分氨基酸合成肽免疫動(dòng)物，均可保護(hù)試驗(yàn)或本體動(dòng)物抵抗強(qiáng)毒攻擊。

本發(fā)明的目的在于提供一種用VP1的完整基因或部分片段在不同的表達(dá)載體中制造一種能有效預(yù)防家畜口蹄疫病毒的、安全高效的疫苗，同時(shí)提供其相應(yīng)的制造方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：用口蹄疫病毒接種小白鼠，從發(fā)病死亡的小白鼠組織中提取口蹄疫病毒RNA，擴(kuò)增出VP1的完整基因：???ACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCTGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGACCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGGCGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTATTGGCTCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGCGCCATCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCAAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTG

該序列是在包括植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子在內(nèi)的植物反應(yīng)器中形成的立體結(jié)構(gòu)之總和，其分子量為30-150KD_a。

本發(fā)明是一種家畜口蹄疫病毒重組基因工程苗，包括編碼口蹄疫病毒毒株VP1蛋白的完整基因，將轉(zhuǎn)基因植物種子作種用，播種待植物成熟后用作家畜飼料即可獲得口蹄疫病毒的免疫功能。

本發(fā)明的家畜口蹄疫病毒基因工程苗的制造方法，包括基因重組、重組蛋白的制備，其具體的制造過程為：(1)將VP1全基因插入質(zhì)粒載體：采用分子生物學(xué)的方法提抽病毒的核酸RNA，用含啟動(dòng)子和終止子，其上游引物為5’AGCGGATCCTGTCATGGCCACTGTTGAA3’，反轉(zhuǎn)錄引物為5’AAGGGGATCCTCTAGAGTCTACTTGAG3’的特定引物擴(kuò)增出VP1的完整基因，片段兩端為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，用BamHⅠ酶切表達(dá)載體pROK1和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒pROK1.VP1，然后(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子：將重組質(zhì)粒pROK1.VP1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C58C1菌株細(xì)胞系，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子，再(3)取種子種入土壤，獲得可作為疫苗的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。