[發(fā)明專利]性染色體短串聯(lián)重復(fù)序列四位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增試劑盒及擴(kuò)增法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01111085.6
• 申請日: 2001-04-02
• 公開（公告）號: CN1377973A
• 公開（公告）日: 2002-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 伍新堯;李建金
• 申請（專利權(quán)）人: 中山醫(yī)科大學(xué)科技開發(fā)部
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)領(lǐng)域聚合酶鏈反應(yīng)復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)。

短串聯(lián)重復(fù)序列(short?tandem?repeat，STR)是人類基因組中一類重復(fù)序列，對于某個基因座(又稱位點(diǎn))上的STR來說，其重復(fù)單位(又稱核心序列)往往是相同的，在人群中不同個體之間因?yàn)楹诵男蛄械闹貜?fù)次數(shù)不同，這一片段的DNA長度也不同。用擴(kuò)增技術(shù)可將同一個基因座上的、不同個體之間存在的各種不同的STR片段(等位基因)擴(kuò)增并顯示出來。STR序列廣泛分布于染色體的DNA序列中。大量的遺傳學(xué)群體調(diào)查證明，在常染色體中的STR片段(等位基因)是按照孟德爾遺傳規(guī)律一代一代傳下去的。

X、Y染色體是人體的性染色體。X染色體通過母親傳給子女，而Y染色體則通過父親傳給兒子。在性染色體中同樣存在許多STR位點(diǎn)，而且這些位點(diǎn)是以單倍型的方式傳遞的。因此，可以通過分別檢測X或Y染色體上的STR位點(diǎn)的等位基因組成的單倍型來區(qū)分個體，或確定有爭議的母子、母女或父子之間是否存在親生關(guān)系。不過，由于單個STR位點(diǎn)所含有的等位基因數(shù)量有限，因此分辨能力不高。

為了提高檢測STR位點(diǎn)的分辨能力，以往的做法是增加檢測的STR位點(diǎn)。但每一次實(shí)驗(yàn)只能增加一個位點(diǎn)。這樣，大大增加了工作量，耗時費(fèi)力。而且在檢測實(shí)踐中，送到實(shí)驗(yàn)室的檢材的量往往很少，不足以做多次實(shí)驗(yàn)用。如何解決這個問題十分重要。

本發(fā)明的目的是提供一種新的試劑盒，這種試劑盒可同時對X或Y性染色體的四個位點(diǎn)的STR等位基因分型，并使分辨率明顯提高。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種新的擴(kuò)增方法，以提高特異性。

本發(fā)明的試劑盒主成份為

X引物對HPRT、DXS6799、DXS6804和DXS7132，或/和Y引物對DYS389、DYS390、DYS19和DYS388。

各引物對的濃度為0.1～0.4Aμmol/L，其中A＝1～50。

本發(fā)明的試劑盒輔助成份為

反應(yīng)緩沖液成份：內(nèi)含KCl?50Ammol/L，Tris-HCl(pH8.4)10Ammol/L，MgCl₂?1.5Ammol/L，明膠0.05Ag/L，其中A＝1～50。

dNTP：0.15Ammol/L，其中A＝1～50。

本發(fā)明的試劑盒還可包括

Taq?DNA聚合酶0.5~1A?U，其中A＝1～50。

上述A值可以大于50，即可以將各種試劑配制成更濃些，或至飽和、或是固體。使用時用水稀釋。

以上試劑是同時對X或Y性染色體的四個位點(diǎn)的STR等位基因分型進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時使用的成分。將它們放在一起，做成試劑盒，以方便使用。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時，將其配成PCR反應(yīng)液，加入微量被檢模板DNA，按下面介紹的擴(kuò)增方法進(jìn)行熱循環(huán)。

本發(fā)明的試劑盒可不含Taq?DNA聚合酶，而在反應(yīng)時與被檢模板同時加入。

本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)方法包括如下步驟：

1、將上述引物、反應(yīng)緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶和被檢模板DNA混合，必要時加水稀釋；

2、將混合反應(yīng)液進(jìn)行熱循環(huán)：95℃?5min；然后94～95℃?45S，50-60℃?45S，70-72℃?1min，30個循環(huán)；最后72℃?5min。

下面給出實(shí)施例。一、試劑盒：包括

X引物對HPRT、DXS6799、DXS6804和DXS7132，或/和，Y引物對DYS389、DYS390、DYS19和DYS388，各引物對的濃度為1μmol/L；

反應(yīng)緩沖液成份：內(nèi)含KCl?500mmol/L，Tris-HCl(pH8.4)100mmol/L，MgCl₂?15mmol/L，明膠0.5g/L；

dNTP：1.5mmol/L；

Taq?DNA聚合酶5U。二、PCR反應(yīng)內(nèi)容物配制

用上述試劑盒(A＝10)試劑配反應(yīng)操作液，總體積50μl。含KCl?50mmol/L，Tris-HCl(pH8.3)10mmol/L，MgCl₂?1.5mmol/L，明膠0.05~0.15g/L，dNTP?0.15mmol/L，X或Y引物對各0.1~0.4μmol/L，Taq?DNA聚合酶0.5~1U，加入被檢模板DNA?0.5~20ng。三、熱循環(huán)

預(yù)變性95℃?5min；然后94℃?45s，50～60℃?45s，72℃?1min，30個循環(huán)；再72℃?5min。4℃保存。四、常規(guī)電泳分析