[發(fā)明專利]遼寧堿蓬膽堿加單氧酶基因及其克隆

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01106075.1
• 申請日: 2001-01-12
• 公開（公告）號: CN1364905A
• 公開（公告）日: 2002-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李秋莉;高曉蓉;安利佳
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué);遼寧師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/52;C12P19/34
• 代理公司: 大連理工大學(xué)專利事務(wù)所
• 代理人: 侯明遠(yuǎn)

本發(fā)明是遼寧堿蓬膽堿加單氧酶基因及其克隆，屬于生物工程領(lǐng)域。特別涉及到遼寧堿蓬(S.liaotungensis?kitag.)編碼膽堿加單氧酶的基因及其克隆。

對非生物脅迫的普遍適應(yīng)是積累與細(xì)胞代謝相容的有機(jī)溶質(zhì)，廣泛存在的最普遍的滲透物質(zhì)是甘油、甘露醇、脯氨酸、蔗糖、海藻糖和銨的四價化合物。甜菜堿就是一類季銨化合物，在細(xì)菌、藻類、動物和多種植物中普遍存在，其中藜科、禾本科等植物在干旱或鹽脅迫下甜菜堿的積累更為明顯。甜菜堿除定位于葉綠體外還存在于微粒體和胞漿中。對細(xì)菌和植物的研究都表明甜菜堿的存在與耐滲透脅迫有關(guān)。甜菜堿起著無毒滲透保護(hù)劑的作用，它的積累使得許多代謝中的重要酶類在滲透脅迫下能保持活性。Saneoka等人證明，含甜菜堿的玉米在鹽脅迫下比缺失型所受的損傷明顯下降。甜菜堿是以膽堿為底物經(jīng)兩步酶催氧化生成，即：膽堿→甜菜堿醛→甜菜堿。在高等植物中，催化第一步反應(yīng)的是膽堿加單氧酶(choline?monooxygenase?CMO)，催化第二步反應(yīng)的是甜菜堿醛脫氫酶(betaine?aldehyde?dehydrogenase?BADHE.C.1.2.1.8)。這兩個酶的活性受鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)。目前只有極少數(shù)幾種植物的膽堿加單氧酶基因被測序克隆。遼寧堿蓬(S.Liaotungensis?kitag.)是一種耐鹽性很強(qiáng)的鹽生植物，其膽堿加單氧酶活性較高。

本發(fā)明提供了遼寧堿蓬(S.Liaotungensis?kitag.)編碼膽堿加單氧酶的基因CMO，提供了CMO?cDNA全序列及其相應(yīng)的氨基酸序列。提供了含有CMO的克隆載體pUC19-CMO和含有這種載體的大腸桿菌(E.coli)JM109細(xì)胞JM109-pUC19-CMO。提供了CMO的植物表達(dá)載體pBI121-CMO和含有這種載體的大腸桿菌(E.coli)JM109細(xì)胞JM109-pBI121-CMO。利用本發(fā)明，可以進(jìn)行植物基因轉(zhuǎn)化，提高植物耐鹽、耐低溫及耐旱性。

本發(fā)明以菠菜(Spinacia?oleracea?L.)、甜菜(Beta?vulgaris)的膽堿加單氧酶基因CMO核苷酸序列作參考，根據(jù)同源性較好的區(qū)域設(shè)計并合成兩條寡核苷酸引物，提取遼寧堿蓬(S.Liaotungensis?kitag.)總RNA為模板，RT-PCR方法合成CMO的部分片段，并對此PCR產(chǎn)物測定核苷酸序列。根據(jù)此序列，在靠近5′端一側(cè)設(shè)計一條反轉(zhuǎn)錄引物，兩對嵌套PCR引物，5′RACE法合成CMO的5′端片段，對此片段進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序。根據(jù)第一個片段的序列，在靠近3′端一側(cè)設(shè)計一條引物，3′RACE法合成CMO的3′端片段，對此片段進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序。這樣獲得了遼寧堿蓬(S.Liaotungensis?kitag.)CMO?cDNA全序列，根據(jù)CMO?cDNA全序列，設(shè)計兩條引物，RT-PCR法合成CMO基因編碼區(qū)，并將CMO基因編碼區(qū)克隆到克隆載體pUC19，形成CMO克隆載體pUC19-CMO。熱擊法將這個克隆載體導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli)JM109感受態(tài)細(xì)胞，形成含有pUC19-CMO的大腸桿菌細(xì)胞JM109-pUC19-CMO。將pUC19-CMO和植物表達(dá)載體pBI121分別用限制性內(nèi)切酶切割，形成互補(bǔ)的粘性末端，T₄DNA連接酶連接，形成CMO的植物表達(dá)載體pBI121-CMO，熱擊法將這個表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli)JM109感受態(tài)細(xì)胞，形成含有pBI121-CMO的大腸桿菌細(xì)胞JM109-pBI121-CMO。

遼寧堿蓬(S.liaotungensis?kitag.)CMO?cDNA核苷酸序列如下：

其中前面的小寫字母表示5′端非編碼區(qū)，中間大寫字母為編碼區(qū)(既開放閱讀框架)，后面的小寫字母表示3′端非編碼區(qū)。為翻譯起始密碼，為翻譯終止密碼，為加poly(A)信號。