[發明專利]定量膽固醇的方法

無效

• 申請號: 00805343.X
• 申請日: 2000-03-17
• 公開（公告）號: CN1344371A
• 公開（公告）日: 2002-04-10
• 發明（設計）人: 山本光章;高橋洋子;谷口由利子;小田原祥子;中西一夫;中村光浩;日野浩一
• 申請（專利權）人: 第一化學藥品株式會社
• 主分類號: G01N33/92
• 分類號: G01N33/92
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 吳亦華

技術領域

本發明涉及膽固醇的定量測定方法，該方法能夠區分地定量測定特定脂蛋白部分中的膽固醇含量，利用少量樣本經過簡單操作即可實現。

背景技術

膽固醇等脂質在血清中與脫輔基蛋白質結合形成脂蛋白。根據它們的物理性質，脂蛋白分為乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。在這些脂蛋白中，LDL是引起動脈硬化的物質之一，而HDL已知表現出抗動脈硬化作用。

從流行病學觀點來看，LDL中的膽固醇值與動脈硬化發生頻率具有正向的相互關系，而HDL中的膽固醇值已知與動脈硬化發生頻率具有反向的相互關系。當今，經常出于缺血性心臟病的預防和診斷目的而測量HDL和LDL中的膽固醇值。已知作為測量HDL和LDL中的膽固醇的方法，例如通過超速離心從其他脂蛋白中各分離HDL和LDL后測量膽固醇的方法、通過電泳分離HDL和LDL、對脂質進行染色再測量顏色強度的方法。

不過，這些已知方法中沒有一種用于每天的實踐，其原因例如操作復雜、不能處理大量樣本等。

廣泛用在臨床檢查領域中的測量HDL中的膽固醇的方法是一種沉淀方法，包括向樣本中加入沉淀劑，引起除HDL以外的脂蛋白聚集，通過離心除去聚集物，測量僅含有HDL的上清液中的膽固醇。盡管與超離心方法和電泳分析相比，這種方法簡單易行，不過該方法不僅由于要加入沉淀劑進行分離操作而要求比較大量的樣本，而且涉及巨大風險的分析誤差。因此，全部分析操作的完全自動化已是不可能的。

已經研究了HDL中的膽固醇的區分酶測定方法。例如，在膽汁鹽和非離子表面活性劑的存在下的酶反應是已知的(日本專利申請公開No.126498/1988)。這種方法利用酶反應的進行在最初階段與LDL膽固醇濃度成比例而在后面階段與HDL膽固醇濃度成比例這一性質。不過，該方法的分析精度是有問題的，因為完全區分HDL中的膽固醇反應與其他脂蛋白中的膽固醇反應是不可能的。

另一種本領域已知的方法包括預先聚集除HDL以外的脂蛋白，僅使HDL中的膽固醇進行酶反應，滅活酶，與此同時重新溶解聚集物，測量吸光度(日本專利申請公開No.242110/1994)。不過，這種方法僅能適用于有限的自動分析儀，因為要求試劑至少加入三次。因此，該方法的普遍性是有限的。從對分析儀器的損害和試劑的處理等觀點來看，該方法也是不令人滿意的，因為沉淀的重新溶解要求使用高濃度鹽等。

日本專利No.2600065公開了使用常規沉淀法所用的用于沉淀除HDL以外的脂蛋白的沉淀試劑和常用于膽固醇測量的試劑測量HDL中還沒有沉淀出來的膽固醇的方法。所公開的具體實例是改性酶與硫酸α-環糊精的組合。

其他方法包括使用表面活性劑降低沉淀劑干擾的方法(日本專利申請公開No.116996/1996)、代替常規沉淀試劑而使用用于沉淀除HDL以外的脂蛋白的抗體的方法(日本專利申請公開No.96637/1997)、使用角叉菜膠的方法(日本專利申請公開No.121895/1997)和使用糖化合物的方法(日本專利申請公開No.301636/1995)。這些方法所具有的問題例如即使在混合正常血清的情況下也會因聚集作用而形成渾濁，要求聚集除HDL以外的脂蛋白(LDL、VLDL等)，而它們的測量是不必要的等。作為臨床檢查領域廣泛接受的測量LDL中的膽固醇的方法，Friedwald的方法(《臨床化學》18卷459-502頁(1972))是已知的。按照這種方法，利用由酶方法所測定的總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯的量測定LDL膽固醇的量。不過，當甘油三酯的濃度超過400mg/dl時，不能適用這種方法。

因此，本發明的目的是提供特定部分中的膽固醇的定量測定方法，該方法不要求離心等預處理，通過簡單操作即可進行，能夠適用于各種類型的自動分析儀。

發明的公開

作為深入研究的結果，本發明的發明人已經發現，如果在與樣本中脂蛋白之一具有較強親合性的化合物和對樣本中其他脂蛋白表現較強作用的表面活性劑的存在下進行膽固醇測定酶試劑的反應，則有可能提供樣本中特定脂蛋白所含有的膽固醇的反應與包括在其他脂蛋白中的膽固醇的反應之間的顯著性差異，由此能夠區分并測定目標脂蛋白中的膽固醇，基本上具有足夠高的精度。

具體而言，本發明提供選擇性定量膽固醇的方法，包括在與樣本中的非測量脂蛋白具有較強親合性的化合物、對測量脂蛋白表現較強作用的表面活性劑和膽固醇測定試劑的存在下，測定在樣本中的測量脂蛋白部分中的膽固醇的量。