[發明專利]使用不同的核苷酸混合物的DNA測序方法和用于該方法的試劑盒

無效

• 申請號: 00803086.3
• 申請日: 2000-11-25
• 公開（公告）號: CN1338004A
• 公開（公告）日: 2002-02-27
• 發明（設計）人: 樸韓浯;俞在亨
• 申請（專利權）人: 株式會社百尼爾
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 丁業平,王維玉

技術領域

本發明涉及采用雙脫氧核苷酸介導的鏈終止反應的DNA核苷酸序列分析方法，更具體地講，涉及通過一步分離步驟進行DNA序列分析的測序方法，所述DNA序列比可由常規桑格測序法所能分析的序列長度更長，該方法的特征在于：采用其雙脫氧核苷酸與脫氧核苷酸的摩爾比彼此不同的兩種核苷酸混合物來產生DNA片段。

背景技術

已經知道，桑格雙脫氧核苷酸介導的鏈終止法是用于分析DNA核苷酸序列的常規方法。在桑格法中，DNA核苷酸鏈通過和在戊糖的C-3位含有取代的羥基的脫氧核苷酸(dNTP)反應而延長，并通過和在戊糖的C-3位不含有取代的羥基的雙脫氧核苷酸(ddNTP)反應而終止。

在桑格法中，四種dNTP如脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)和脫氧胞苷三磷酸(dCTP)用作產生與模板DNA互補的DNA片段的底物。四種ddNTP如雙脫氧鳥苷三磷酸(ddGTP)、雙脫氧腺苷三磷酸(ddATP)、雙脫氧胸苷三磷酸(ddTTP)和雙脫氧胞苷三磷酸(ddCTP)用作用于終止互補DNA片段的鏈延長反應的底物。與dNTP不同，ddNTP在戊糖的C-3位不含有羥基。因此，當ddNTP和延長反應中的互補DNA片段的末端反應時，互補DNA片段的鏈延長反應被終止。

因此，在桑格法中產生了不同長度的其末端被ddNTP終止的DNA片段。在桑格法中，產生了與模板DNA的核苷酸數目相對應的不同的互補DNA片段，進而通過電泳，按分子量的順序將其進行分離。之后，通過測定每個互補DNA片段的末端堿基來識別模板DNA的核苷酸序列。

然而，盡管桑格法很方便，但是它的一個缺陷在于，由于互補DNA延長反應的持續合成能力是有限的，只有長度在500-700bp的DNA可以被準確測定。例如，為了準確和完整地識別平均長度為2Kb的人類cDNA，DNA測序步驟需要通過對人類cDNA的分割來重復三次以上。如上所解釋的，作為長DNA的測序方法，桑格法是一種費時、費力和昂貴的方法。

同時，在所謂的鳥槍法(已知是用于基因組DNA的大規模核苷酸測序方法)中，全長DNA被分割為幾個DNA片段，分別識別每個片段的堿基的序列。之后，使用計算機相互比較每個片段的序列，通過刪除重疊部分來分析全長DNA序列。在上述鳥槍法中，利用可通過一次DNA序列分析識別的DNA長度的擴展來縮減全長DNA序列分析所需的時間和勞力。

通常，在常規的桑格雙脫氧核苷酸介導的鏈終止方法中，采用單一的DNA聚合酶。因此，對應于模板DNA20-30bp的短DNA片段和對應于模板DNA600-700bp的長DNA片段少量生成。然而，對應于模板DNA40-500bp的DNA片段大量生成。所以，短DNA片段和長DNA片段的含量相對較低，從而DNA兩端末端部分的核苷酸序列比其中間部分難以測定。

由于上述原因，可通過對核苷酸序列的一次分析進行分析的DNA的長度實際上受到限制。因此，人們長期以來為得到一種新方法進行了多種研究，該方法應能擴展通過核苷酸序列的一次分析來識別的DNA長度，所述核苷酸序列的一次分析是借助對模板DNA兩端末端部分更準確的測定進行的。

發明的公開

因此，本發明的目的在于提供一種通過核苷酸序列的一次分析測定較長DNA序列的方法以及該方法所用的試劑盒。本發明的方法是對常規桑格DNA測序方法的改進，它可以用于測定比可由桑格測序方法所測定的更長的DNA。

在憑借雙脫氧核苷酸介導的鏈終止反應的常規DNA測序方法中，核苷酸混合物中ddNTP與dNTP的摩爾比(在下文中，ddNTP與dNTP的摩爾比以“ddNTP/dNTP”表示)為約0.02，也就是說，ddGTP/dGTP是0.02-0.05；ddATP/dATP是0.02-0.058；ddTTP/dTTP是0.02-0.1；ddCTP/dCTP是0.02-0.033。

本發明的目的是通過提供如下一種方法實現的：采用其中雙脫氧核苷酸與脫氧核苷酸的摩爾比彼此不同的兩種以上的核苷酸混合物，即采用其中雙脫氧核苷酸與脫氧核苷酸的摩爾比高于常規桑格法中的摩爾比或低于常規桑格法中摩爾比的兩種以上的核苷酸混合物進行DNA序列分析的方法。