[發明專利]編碼zwal基因的新核苷酸序列

無效

• 申請號: 00134034.4
• 申請日: 2000-12-07
• 公開（公告）號: CN1304998A
• 公開（公告）日: 2001-07-25
• 發明（設計）人: 貝蒂娜·默克爾;瓦爾特·普費弗勒;阿希姆·馬克思;約恩·卡利諾夫斯基;布里吉特·巴特;阿爾弗雷德·普爾勒
• 申請（專利權）人: 德古薩－于爾斯股份公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12N15/31;C12N15/52;C12N15/63;C12N15/64;C12P13/04;C12Q1/68;//;C12R115)
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發明提供了編碼zwa1基因的核苷酸序列，和用棒狀細菌經發酵生產氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其中該棒狀細菌中zwa1鑒于是擴增的。

氨基酸，尤其L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業，尤其用于動物營養。

已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發酵生產。由于其極其重要，已持續進行改良生產方法的嘗試。生產方法的改良可涉及發酵措施，如攪拌及供氧，或營養培養基的組分如發酵期間的糖濃度，或產物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產性質。

為改良這些微生物的生產性質，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性，或重要的調節氨基酸缺陷的并產生L-氨基酸的菌株。

一段時間以來，重組DNA技術的方法也用于棒桿菌生產氨基酸的菌株的改良，其通過擴增各個氨基酸生物合成基因，并研究對氨基酸生產的作用而進行改良。此方面的綜述文章見Kinoshita(“谷氨酸細菌”，工業微生物的生物學，Demain和Soman編輯，BenjaminCummings英國倫敦，1985,115-142),Hilliger(生物技術2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技術的關鍵回顧15,73-103(1995))和Sahm等(紐約科學協會年報782,25-39(1996))。

本發明人目的在于提供改良的經發酵生產氨基酸，尤其L-賴氨酸的新措施。

氨基酸尤其L-賴氨酸用于人用藥物，制藥工業，特別是動物營養。因此提供生產氨基酸特別是L-賴氨酸的新改良方法是令人感興趣的。

當下文提及L-賴氨酸或賴氨酸時，不僅指堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。

本發明提供了來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列：

a)與編碼包括SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，

b)編碼包括與SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)互補于a)或b)的多核苷酸序列的多核苷酸，及

d)包括a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續核苷酸的多核苷酸。

本發明還提供了如權利要求1的多核苷酸，其優選是能復制的DNA，包括：

(ⅰ)SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或

(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，及任選地

(ⅳ)(ⅰ)序列中有功能的中性有義突變。

本發明還提供了：

如權利要求2的多核苷酸，其包括SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列，其中該多核苷酸是在棒狀細菌中能復制的優選地重組的DNA，

如權利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的多肽，

一種含有編碼谷氨酸棒桿菌zwa1基因的DNA序列的載體，其包含于載體(質粒)pCR2.1zwa1exp中，保藏于大腸桿菌Top10F’，保藏號DSM13115，

及作為宿主細胞的棒狀細菌，其含有權利要求6的載體，或其中zwa1基因是擴增的。

本發明還提供了多核苷酸，其基本上包括一多核苷酸序列，其可通過用包括SEQ?ID?NO:1所述多核苷酸序列或其部分的探針雜交相應的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述文庫包括具有相應于SEQ?ID?NO:1的多核苷酸序列的完整基因。

本發明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼zwa1基因產物的全長cDNA，以及分離那些具有與zwa1基因序列高度相似性的cDNA或基因。

本發明的多核苷酸序列還適用作引物，借助于其，通過聚合酶鏈反應(PCR)，可制備編碼zwa1基因的基因DNA。

這種用作探針或引物的寡核苷酸包括至少30個，優選至少20個，更優選至少15個連續核苷酸。長度為至少40或50個核苷酸的寡核苷酸也是合適的。

“分離的”意為從其天然環境中分離出來。

“多核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。

“多肽”是指含有經肽鍵結合的兩或多個氨基酸的肽或蛋白質。