[發(fā)明專利]小鼠巢蛋白基因啟動子及其組織特異性增強(qiáng)子

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00127624.7
• 申請日: 2000-11-30
• 公開（公告）號: CN1355317A
• 公開（公告）日: 2002-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 景乃禾;程樂平;高翔
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/42
• 分類號: C12N15/42;C12N15/63;C12N15/64;C12P19/34;C07H21/00
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 徐迅

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和DNA重組技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及巢蛋白基因的啟動子及其組織特異性增強(qiáng)子，以及它們的用途。

哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)是由胚胎早期的神經(jīng)管發(fā)育分化而來的。在這個復(fù)雜的分化過程中，涉及許多神經(jīng)組織特異性及神經(jīng)細(xì)胞特異性基因的階段性表達(dá)。巢蛋白(nestin)作為中等纖維蛋白家族的一員，因其在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞中的特異性表達(dá)而被克隆，并被作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記分子而被廣泛應(yīng)用。

目前，大鼠和人的巢蛋白基因都已被克隆。轉(zhuǎn)基因動物的結(jié)果顯示，在大鼠巢蛋白基因第一個內(nèi)含子中，存在調(diào)控該基因在肌肉組織中表達(dá)的增強(qiáng)子序列，而在第二個內(nèi)含子中，存在調(diào)控巢蛋白基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的增強(qiáng)子序列。人的巢蛋白基因表達(dá)調(diào)控亦有類似的元件存在。巢蛋白基因的第二個內(nèi)含子已被用來指導(dǎo)某些外源基因在神經(jīng)組織中專一性表達(dá)。

然而，在本申請之前，還沒有獲得小鼠巢蛋白基因序列以及有關(guān)的調(diào)控序列。

鑒于小鼠是一種重要的試驗動物，而且巢蛋白是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達(dá)的蛋白，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)小鼠的巢蛋白基因序列以及有關(guān)的調(diào)控序列。

本發(fā)明的目的就是提供一種新的小鼠巢蛋白基因序列以及有關(guān)的調(diào)控序列。

本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些調(diào)控序列的方法以及所述調(diào)控序列的用途。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種啟動子元件，該啟動子元件包括巢蛋白基因啟動子的核苷酸序列。較佳地，所述的啟動子元件包含SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種增強(qiáng)子元件，它包括小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子的核苷酸序列。較佳地，所述的增強(qiáng)子元件包含SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于在神經(jīng)干細(xì)胞中特異性表達(dá)的構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權(quán)利要求3所述的增強(qiáng)子元件。較佳地，所述構(gòu)建物還含有與該外源基因可操作地連接的 1所述的啟動子元件。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，該載體含有上述的啟動子元件和/或增強(qiáng)子元件。較佳地，所述的載體是表達(dá)載體和質(zhì)粒。

在本發(fā)明的第五方面，提供了一種在神經(jīng)干細(xì)胞中特異性表達(dá)外源基因的方法，它包括步驟：

(a)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的增強(qiáng)子元件，所述的增強(qiáng)子元件包含小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子的核苷酸序列，

(b)將步驟(a)中的構(gòu)建物導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，使外源基因在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，步驟(a)中構(gòu)建物還含有與外源基因可操作地連接的巢蛋白基因啟動子元件。

本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。

圖1顯示了小鼠巢蛋白基因的結(jié)構(gòu)。

圖2是構(gòu)建物pNH84的結(jié)構(gòu)圖。

圖3顯示了對小鼠巢蛋白基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染分析的結(jié)果。

圖4顯示了對與熒光素酶報道基因相連的小鼠巢蛋白第二個內(nèi)含子進(jìn)行系列缺失的示意圖。

圖5顯示了對小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染分析的結(jié)果。

圖6顯示了小鼠巢蛋白基因的第二內(nèi)含子使外源基因(報道基因LacZ)在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中表達(dá)。圖6A顯示了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA片段的結(jié)構(gòu)。圖6B和6C顯示了在小鼠巢蛋白基因的啟動子和第二內(nèi)含子的指導(dǎo)下，報道基因lacZ在CNS中特異性地表達(dá)。

圖7顯示了小鼠巢蛋白基因的啟動子元件的核苷酸序列。

圖8顯示了小鼠巢蛋白基因的增強(qiáng)子元件(即第二內(nèi)含子)的核苷酸序列。

本發(fā)明人通過篩選小鼠細(xì)菌人工染色體(BAC)基因組文庫，獲得小鼠巢蛋白基因。構(gòu)建系列缺失質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染胚胎性癌細(xì)胞(Embryonal?Carcinoma，EC)P19鑒定出小鼠巢蛋白基因的啟動子及增強(qiáng)子區(qū)域。利用小鼠巢蛋白基因的啟動子及其組織特異性增強(qiáng)子，得到在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)報告基因LacZ的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠巢蛋白基因的啟動子及其增強(qiáng)子可用于在P19細(xì)胞中表達(dá)外源基因或增強(qiáng)外源基因的表達(dá)。

如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。