[發明專利]測定DNA序列的方法

無效

• 申請號: 00115385.4
• 申請日: 2000-04-13
• 公開（公告）號: CN1272551A
• 公開（公告）日: 2000-11-08
• 發明（設計）人: 王慶康;劉建華;林志新;劉燕剛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交通大學專利事務所
• 代理人: 王錫麟

本發明涉及的是一種測定DNA序列的方法，屬于生物信息測試技術領域。

DNA序列測定及分析是人類基因組工程的重要一環。目前使用的DNA序列分析法是雙脫氧法，基本原理是將特異的引物與待測DNA配對，在含有雙脫氧核苷酸的脫氧核苷酸混合物存在下，DNA聚合酶對待測DNA復制并在特異的位點終止，然后用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分離。實驗中用放射性同位素或熒光染料示蹤，這種方法較為繁瑣。申請號95197574.9“用于DNA測序和DNA鑒定的方法和裝置”，該專利基于尼龍膜上的DNA樣品矩陣，而探針儲存于多孔板，根據其權利要求1中所描述的方法，需重復從給定長度的一套不完全探針中選擇探針，而且必須重復進行雜交，以獲得數據擬合所需信息，每一循環都要進行探針篩選，這給實際使用者帶來難度，實施過程中的步驟較復雜。

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種測定DNA序列的方法。

本發明的技術方案及其實施情況如下：

將A、C、G、T構成的長度為L的所有組合的寡核苷酸片段固定于DNA芯片上，序列待測的DNA片段是熒光標記的一組長度為L，連接位點處的nz個核苷酸是已知的隨機片段，同時與DNA芯片一起保溫，進行DNA配對，與待測DNA序列配對的寡核苷酸片段被連接起來，反應后清洗DNA芯片，然后用掃描儀檢測，可以獲得待測DNA片段中各種序列出現的頻率，可以反推出待測DNA片段的核苷酸序列。

DNA芯片的結構：芯片的總寡核苷酸探針點數n＝4^Lxy，在一個二維構成的芯片平面，可以在X、Y軸上各選擇4^nx，4^ny個點，并滿足下列條件：4^nx×4^ny＝4^Lxy，DNA芯片就可實現序列展開和反演。

寡核苷酸探針被連接已知核苷酸片段：序列長度為L，但只有連接點的nz個核苷酸是已知的熒光標記的寡核苷酸片段。其已知的種類由連接位點已知核苷酸的數目決定。連接位點已知核苷酸是1個時，就只有4種。連接位點已知核苷酸是2個時，就有16種，連接位點已知核苷酸是nz個時，就有4^nz種。待測DNA段與DNA芯片發生各種配對連接反應，信息總量是一種X、Y、Z軸構建的立體結構，其中可包含的序列總量是N＝4^nx×4^ny×4^nz種，而每種寡核苷酸片段序列(此時的長度為L＝L_xy+nz)在這種三維結構中有一個特定的位置。

DNA序列是由ATCG四個編碼構成的生命信息序列，對于長度為L的序列，其ATCG全組合的總數是n＝4^L。這樣任何一個DNA序列，其長度為L的片段，必定是n＝4^L全排列中的一個。這樣，任何一DNA序列都可用長度為L的ATCG全組合片段來描述，稱之為序列展開。當長度為L的序列的ATCG全組合集合作為探針固定于DNA芯片，就可用DNA芯片實現序列展開。通過逆向過程，可推算出待測樣品的序列，稱之為序列反演。

把一長度為L的ATCG全組合集合作為探針固定在DNA芯片上，通過DNA配對原則(A-T，C-G)，待測DNA樣品序列的片段與芯片上的DNA探針匹配，并攜帶熒光標記。然后，用掃描器對與樣品作用過的DNA芯片進行掃描檢測。就可獲得DNA芯片上的熒光點的分布模式，這一分布模式，按四進制方式在芯片上進行位置編碼。但由于DNA芯片的信息是平行處理，從DNA芯片上測得的熒光分布模式不能確定與探針匹配的片段在整個樣品序列中的位置，這樣就必須用遞推的方法。從已知的核苷酸片段開始，逐個片段遞推。由于每個片段的下一個遞推片段存在四個可能性，所以，遞推的結果不是唯一的。遞推結果的個數取決于探針的長度和樣品序列的長度，及樣品序列內在的簡并性。但遞推結果必有一個是實際待測樣品序列。仿真實現如下：

根據上述序列展開及反演技術，采用長度為11的寡核苷酸序列的ATCG全組合作為DNA芯片的DNA探針。根據n＝4^L，則共有4194304個DNA探針，采用三維立體陣列排列方法，把DNA探針排列如下：256(X方向)×256(Y方向)×64(Z方向)制成64塊256×256點陣的DNA探針陣列芯片。用計算機仿真了長度為2～5Kb待測樣品序列結果。驗證了本發明的技術方案。本發明比現有方法具有實質性特點和顯著進步，本發明具有明顯的優點。如：